嵌合体实验分析ES细胞分化潜能

常规的通过嵌合体技术检测 ES 细胞全能性的方法是将 ES 细胞注射到正常二倍体胚胎的囊胚腔，获得嵌合体动物后再进行杂交，获得 ES 细胞的种系传递。这种方法结果很稳定，效率也很高，是检测干细胞全能性和制作基因打靶小鼠的常规技术。但是，由于需要对获得的嵌合体小鼠进行杂交选育才能确定其是否能够实现种系传递，所需的时间比较长，操作比较烦琐。在制作基因打靶小鼠时，需要分别获得雌性和雄性的嵌合体小鼠，然后通过杂交选育才能获得基因打靶小鼠，如果要获得等位基因双敲除的纯合子小鼠，则需要更多代的杂交选育才能实现。后来又发展出将 ES 细胞注射到四倍体胚胎的囊胚腔，直接获得个体细胞全部来自 ES 细胞的四倍体胚胎互补（tetraploid-embryo.complementation）技术。由于四倍体的细胞在胚胎发育过程中只能参与形成胎盘等胚外组织，而不能形成胚体，而 ES 细胞不能形成胚外组织，因此，注入 ES 细胞后双方可以发生互补，获得的后代胚胎细胞将全部来自 ES 细胞，包括生殖细胞。因此，通过该技术不需进行交配即可证明 ES 细胞的全能性，用于制作转基因动物时也不需进行杂交选育，直接就可以获得转基因动物。

制作嵌合体动物主要有两种方法：聚合法和显微注射法。聚合法是指将去透明带的两个或多个早期胚胎聚集或者将胚胎与多能性干细胞聚集，形成一个嵌合胚胎，移植后获得嵌合体动物的方法；注射法是指采用显微注射的方法，将胚胎卵裂球细胞或多能性干细胞直接注射到 8 细胞期胚胎透明带下或囊胚期胚胎的囊胚腔。早期的注射法是通过带尖的注射针直接穿过透明带和滋养层细胞，将细胞注入囊胚腔。这种注射针制作比较复杂，操作难度大，而且针尖很容易对胚胎内细胞团造成伤害；随着技术的发展，出现了一些能够在透明带和滋养层细胞上穿孔，帮助注射针穿透透明带和滋养层细胞的仪器，极大地简化了嵌合体的制作难度，其中最常用的是 Piezo 驱动器和激光破膜系统。使用仪器穿孔后就可以使用平口的注射针，注射针制作相对简单，显微操作相对简单，对胚胎的损伤也相对较小。