聚合法制作嵌合体小鼠

器材：

① 镊子、离心管、移液管、吸管、培养皿

② 37 ℃、5% CO₂ 的培养箱

③ 显微镜

试剂：

① 小鼠

② PMSG、hCG

③ KSOM、酸性台氏液（acidified Tyrode's solution）

④ 明胶

⑤ PBS

聚合法制作嵌合体小鼠的基本过程为：

4 周龄的 ICR 小鼠腹腔注射 7.5 U 的 PMSG，间隔 48 小时后再腹腔注射 7.5 U 的 hCG 进行超数排卵处理，hCG 注射当日与同种性成熟公鼠交配，次日检栓，将发现阴栓的当天中午 12:00 时记为 0.5 天，于 2.5 天处死有栓小鼠，取输卵管及子宫，收集 8～16 细胞胚胎，置 KSOM 液滴（需要提前一天在培养箱中平衡）中，于 37 ℃、5% CO₂ 的培养箱中备用。同时制备周期同步的假孕母鼠。

① 在进行聚集前的 1～2 天，将 ES 细胞进行传代培养，接种于无饲养层的经明胶（0.1%）包被的组织培养皿。根据实验所需培养数量适合的 ES 细胞克隆。

② 聚集实验当天，移去 ES 细胞培养基，用无钙、镁的 PBS 洗细胞。吸去 PBS 后，加入少量 0.05% 的胰蛋白酶，加入量以刚好覆盖细胞为宜。在 37 ℃ 培养箱中放置 1～2 分钟，在显微镜下观察克隆团边缘卷起脱离皿底，此时加入等体积 ES 培养基终止消化。

③ 用巴氏吸管把克隆从培养皿中吹起，并轻轻吹打 3～4 次使大的克隆团分散，吸到 15 ml 离心管中，800 r/min 离心 5 分钟，弃上清，加入新鲜 ES 细胞培养基重悬，用 1 ml 枪轻轻吹打，置冰上待用。

① 在聚合实验前 1 天，制作聚集板和胚胎培养板。在直径 60 mm 的 Falcon 组织培养皿上用圆头的锥子压制 30 个小窝，将 15 μl 的 KSOM 液滴置于每个小窝上，用液体石蜡覆盖后于培养箱中过夜平衡。

② 在实验当天，制作一个由多个 M2 液滴和酸性台氏液（acidified Tyrode's solution）液滴组成的培养皿，并用液体石蜡覆盖。

① 将在 KSOM 中待用的胚胎从 KSOM 中转移到去透明带平皿的 M2 液滴中，然后将一个胚胎从 M2 中移入到一滴台氏液中，观察透明带是否溶解；当透明带即将完全溶解时将胚胎移入一新的 M2 液滴中，同时用手吸管吹打胚胎，再将胚胎移到新的 M2 液滴。每个胚胎都同样处理，并且不要让胚胎相互接触。

② 将去透明带的胚胎在平衡好的 KSOM 中洗涤 3 遍，把无透明带的胚胎单个放到聚集皿的小孔内，每个小孔只放一个胚胎。

③ 取 200μl 的 ES 细胞悬液，在显微镜下选择 6～15 个细胞的细胞团，把细胞团移到平衡好的 KSOM 中。

④ 将挑选出来的 ES 细胞团放在聚集皿的小孔中，与孔中的每个胚胎接触。

⑤ 将聚集的 ES 细胞和胚胎放入 37 ℃、5% CO₂ 的培养箱中培养 24 小时。

⑥ 培养过夜后，将聚集 ES 细胞的囊胚移植到假孕 3.5 天的代孕母鼠的子宫中。

① 用于培养的 KSOM 液滴需提前一天在培养箱中进行平衡；

② ES 细胞吹散时要轻轻吹打，避免剧烈吹打把 ES 细胞吹成单细胞或吹死；

③ ES 细胞消化后要在 3～4 小时内使用，并放置于冰上，保持细胞有较好的状态；

④ 胚胎去透明带时，需在透明带还未消化完全时就从台氏液中移到 M2 液滴中，避免酸性台氏液对胚胎造成过度损伤；

⑤ 在去透明带后，胚胎很容易受到外界不利环境的影响，因此在胚胎的转移和清洗时必须小心谨慎。