简介
采用显微注射的方法将胚胎卵裂球细胞或多能性干细胞直接注射到 8 细胞期胚胎透明带下或囊胚期胚胎的囊胚腔。早期的注射法是通过带尖的注射针直接穿过透明带和滋养层细胞，将细胞注入囊胚腔。这种注射针制作比较复杂，操作难度大，而且针尖很容易对胚胎内细胞团造成伤害；随着技术的发展，出现了一些能够在透明带和滋养层细胞上穿孔，帮助注射针穿透透明带和滋养层细胞的仪器，极大地简化了嵌合体的制作难度，其中最常用的是 Piezo 驱动器和激光破膜系统。使用仪器穿孔后就可以使用平口的注射针，注射针制作相对简单，显微操作相对简单，对胚胎的损伤也相对较小。
材料与仪器
器材：
① 激光破膜系统 XYclone，x20 的激光物镜镜头，破膜参数：Power 100%，Pulse 300 μs；
② 显微操作系统 OLYMPUS IX71 ＋ ON3
② 注射针（内径为 10～15 μm，外径小于 20 μm）；固定针（内径为 10～20 μm，外径 80～120 μm）。
③ 培养箱
试剂：
① 7～8 周龄雌鼠，雄鼠
② 培养液
③ PBS、麻醉剂等
步骤
激光破膜系统辅助 ES 细胞显微注射法制作嵌合体小鼠的基本过程为：
1. 小鼠超排准备
4 周龄的 ICR 小鼠腹腔注射 7.5 U 的 PMSG，间隔 48 小时后再腹腔注射 7.5 U 的 hCG 进行超数排卵处理，hCG 注射当日与同种性成熟公鼠交配，次日检栓，将发现阴栓的当天中午 12：00 时记为 0.5 天。同时制备周期同步的假孕母鼠。
2. 注射用囊胚的准备
① 见栓后第 3.5 天颈椎脱臼法处死见栓小鼠，打开腹腔找到卵巢和子宫；
② 用小镊子夹住子宫颈靠近膀胱的部位，用锋利的眼科手术剪在子宫颈位置剪开，然后用镊子轻轻往上提，并用眼科剪将子宫系膜剥离；
③ 在卵巢和输卵管之间剪开，将完整的子宫放到 37 ℃ 装有预热 HCZB 的直径 60 mm 的组织培养皿中；
④ 将子宫在 HCZB 中清洗两遍，放到直径 60 mm 装有少量预热的 HCZB 的组织培养皿中；
⑤ 在靠近子宫-输卵管连接部开一个小的切口，将 1 ml 注射器的平口针头插入子宫颈内并轻轻地滑入一侧子宫角底部，然后进行冲洗，每侧子宫角用大约 0.5 ml 的 HCZB 冲洗；
⑥ 体视显微镜下，用移胚管收集胚胎并在 KSOM 培养液滴中洗涤 3 次，去除杂质，然后将胚胎移到平衡好的 KSOM 培养滴中，37 ℃、5% CO2 培养。
3. 注射 ES 细胞准备
① 在注射前 2 小时给 ES 细胞换上新鲜的培养基；
② 移去培养基，用 PBS 洗两遍；
③ 加入适量的 0.05% 胰蛋白酶，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育 10～15 分钟；
④ 加入适量的 ES 细胞培养基，终止消化，轻轻用巴氏吸管吹打三四次，将细胞吹散成单细胞悬液；
⑤ 将细胞悬液移到一新的预先铺盖 0.1% 明胶的组织培养皿中，放回 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育 20～30 分钟；
⑥ 轻轻拿出培养皿，收集含有 ES 细胞的全部培养基，留下贴壁的 MEF 细胞；
⑦ 将收集的培养基重复步骤 ④ 和步骤 ⑤；
⑧ 将最后收集的培养基移入 15 ml 离心管中，200 r/min 离心 5 分钟；
⑨ 弃上清，用 500 μl 培养基重悬，并轻轻吹打成单细胞悬液；
⑩ 冰上放置 15 分钟，吸走 2/3 上清，然后补回 500 μl 培养基；
⑪ 将细胞放冰上待用。
4. 显微注射操作
① 注射前 1 天，在 60 mm 的组织培养皿上做 6～8 个 50 μl 的 KSOM 液滴，并覆盖液体石蜡于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中平衡，作为胚胎存放培养皿。
② 在注射当天，在 60 mm 的组织培养皿盖上做 2 个 40 μl 的 10% PVP 滴，在 PVP 滴下面平行做 2～3 排 40 μl 的 M2 液滴，并覆盖液体石蜡，作为显微注射操作皿。
③ 在显微镜中挑选扩展的囊胚，然后移到另一 KSOM 培养液滴中。
④ 用移胚管将挑选过的 10～15 个囊胚转移到预先做好的显微操作皿中的 M2 液滴中。
⑤ 在相邻的另一个 M2 液滴中加入 2～5 μl（加入量根据细胞密度调节）的 ES 细胞悬液，以细胞与细胞之间留有空隙为好。
⑥ 注射针在吸取 ES 细胞前，在显微操作皿的 10% PVP 液滴中清洗 3～5 遍（反复吸入和吹出），让 PVP 充分清洗注射针内壁。
⑦ 在高倍镜下仔细选择体积较小（一般选择 ≤ 10 μm 的细胞）、形状规则呈单一圆形的 ES 细胞。在 10 分钟左右的时间内，吸取 150～250 个细胞到注射针里，并尽可能让细胞一个紧跟着一个吸入到注射针中，尽量少带液体。
⑧ 用固定针吸住单个囊胚，把它移到显微镜的视野中，借助注射针转动囊胚，使囊胚中的内细胞团（ICM）固定在 12 点或 6 点的方向。
⑨ 调动显微镜的微调，透过显微镜目镜清晰看到胚胎透明带边缘和滋养层细胞，再上下调动注射针，直到清晰看到注射针为止。
⑩ 透过连接计算机的 XYclone 激光破膜系统的成像软件观察囊胚，调节固定针移动囊胚，使胚胎的透明带和滋养层细胞在激光的靶点上，靶点的中心瞄准两个滋养层细胞之间的连接处，激发激光。
⑪ 把吸有 ES 细胞的注射针透过激光破膜系统在透明带和滋养层细胞上打出的孔插入到囊胚腔。如果第一次没有穿透滋养层，可在囊胚腔还没开始塌陷前调整囊胚位置，再激发一次激光。
⑫ 把注射针在囊胚腔中缓慢向固定针移动，到达囊胚腔中央的位置后慢慢从注射针里吹出 10～15 个细胞，使其进入囊胚腔，尽量让细胞贴近 ICM，小心不要让针碰到 ICM，也不要让任何液体石蜡油滴和死细胞进入囊胚腔。
⑬ 注射完后，慢慢把针从囊胚中抽出，小心不要带出细胞。4 注射完一批囊胚（10～15 个）后，将注射后的囊胚移到预平衡的 KSOM 培养液液滴中，37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，等待移植。
5. 嵌合胚胎的移植
① 待全部胚胎注射完成后，胚胎在 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养中培养 1～3 小时后开始移植。
② 受体小鼠腹腔内注射麻醉剂使其麻醉。
③ 用 75% 乙醇消毒小鼠背部，沿背中线从最后肋骨开始，用消毒过的剪刀在皮肤上剪一个小口，在开口左侧（或右侧）查找卵巢，然后再用剪刀在肌层剪一小口，暴露卵巢。
④ 用钟表镊轻轻夹住卵巢的脂肪垫，并拉出附带的卵巢和子宫，改用脂肪夹把脂肪垫夹住固定，暴露卵巢和子宫。
⑤ 在体视镜下把胚胎装入到胚胎移植管中，移植管按照三段法装管：先吸入一小段 KSOM 培养液，然后吸入一个小气泡，再吸取胚胎，吸完胚胎后再吸入一小个气泡和一小段 KSOM 培养液。每只小鼠移植 10～15 个囊胚，每次只移植一侧子宫角。
⑥ 在解剖镜下，用镊子将子宫角靠近卵巢的分轻轻夹住并提起，用 1 ml 注射器的针头在子宫壁上刺一个斜角向上的小口。
⑦ 把注器的针头抽出，插入装有囊胚的移植管，大约插入 5 mm，然后将胚胎慢慢吹入子宫。
⑧ 把卵巢和子宫放回腹腔，用创口夹将创口夹住。
⑨ 术后将小鼠放到 37.5 ℃ 的热台上保温，直到小鼠苏醒为止再转动物房饲养。
注意事项
① 激光破膜系统与 piezo 系统比较，激光所用注射针的安装比 piezo 的方便、快捷，而且不用使用水银等有毒化学品，能吸入更多的细胞，Piezo 在穿透囊胚时给的压力会使靠近注射针口的细胞受压力而破碎，造成较多的细胞死亡，而激光系统避免了这种情况的出现。
② 在激光系统调节激光焦距的时候，要在一般用于显微操作的皿中调节，因为平皿底部的厚度对激光的焦距有所影响，在使用激光破膜时，尽量使用小的脉冲强度。
③ 处理 ES 细胞时，离心力不宜超过 1000 r/min，过大的离心力会使 ES 细胞的胞膜破裂，当 ES 细胞中有过多的 feeder 细胞时，可以多贴壁处理几次，另外，细胞必须在注射当天消化使用，并且在 3～5 小时使用，期间需放置冰上。
④ 注射针的内径不能太大或太小，太大则在吸入和吹出细胞时会有太多的液体被带进注射针和带入到囊胚腔中，太小则很容易使细胞变形破碎，这些都不利于嵌合胚胎的发育存活和嵌合效率，所以注射针内径要根据细胞的大小来挑选，并且尽可能多备注射针。
⑤ 一个新的注射针在 10%PVP 中清洗完后，第一次移到细胞的操作液滴中吸取细胞时要尽可能多地吸细胞（一般注射 10～15 个胚胎所用细胞数），一般注射针在第二次吸取细胞时就会变得不顺畅，吹细胞时也会有延迟，难以控制，很容易会使细胞和针中的液体石蜡油滴进入囊胚腔里，对囊胚做成伤害，因此注射完一批胚胎（10～15 个）时，最好换新的注射针，保持操作的顺畅和缩短胚胎在体外操作的时间。
⑥ 操作平皿的操作液滴不用预热，而且操作的过程中不用恒温板保温，避免 ES 细胞的贴壁和粘管。操作液滴可以多做几个，细胞要保持新鲜。
⑦ 从子宫中冲出来的胚胎发育可能不同步，需要将胚胎分批，先选择囊胚腔扩展较好的胚胎进行注射，囊胚腔较小的胚胎可放到 KSOM 培养液滴中培养一段时间再注射，而已经孵出的胚胎则丢弃不用于注射。
⑧ 挑选细胞和注射一批囊胚的操作时间控制在 30～40 分钟，尽量减少体外操作时间过长对胚胎的影响，所以一批操作的胚胎数量一般不宜超过 20 个。
⑨ 挑选 ES 细胞时，直径小于 10 μm 的 ES 细胞嵌合率较高，小圆形的 ES 细胞用于构建嵌合体优于不规则、胞膜易破者，每个囊胚注射 10～15 个细胞可有较高的正常发育率，又可有较高的嵌合体形成率。
⑩ 注射时，注射针尽量不要接触到内细胞团，注射完如果囊胚腔内有较大的压力，可以先不把注射针抽出，让针尖在囊胚的开口处停留数秒。
⑪ 移植时，可以在吸取胚胎前，在移植管中多吸小液体段和小气泡来缓解毛细管的虹吸作用，避免在吸取胚胎时吸入过多的胚胎和液体，但是在把胚胎吹入到子宫时要留意胚胎段后面的气泡，不能把太多的气泡和液体打入到子宫中而影响胚胎的发育。
来源：丁香实验
