R&D Systems:如何提高MSC的扩增且不损失其分化潜能
R&D Systems
骨髓间充质干细胞（MSC）为组织工程学和再生医学带来重大希望。临床及临床前对MSC的应用需要它们在培养基中以最大效率扩增，并且维持分化为主要细胞系的能力。胎牛血清（FBS）是一种体外维持hMSC生长的要素，但是批次之间的差异能明显影响实验结果。
为了制造能始终如一地使hMSC最优扩增的生长培养基，我们测试了几种来源的FBS的不同浓度。
我们的结果表明FBS样品间的扩增效率差异很大，一次传代后可扩增1.8至4.2倍。使hMSC最大扩增的FBS批次用于开发StemXVivoTM骨髓间充质干细胞扩增培养基。
与另一种市上MSC扩增培养基作比较测验，用StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基传2代后可以扩增5.6倍，相比之下，竞争者的培养基只扩增2.8倍。然后，我们力图证实在StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基中扩增的细胞保有全部的分化潜能。
我们分析了扩增后的细胞表型，发现它们是CD105+，CD90+和CD34-。我测试它们分化为软骨细胞，骨细胞和脂肪细胞的能力。种系特异的抗体染色证明了这些细胞可以有效地分化为软骨细胞，骨细胞和脂肪细胞。
因此，我们表明通过对几批FBS的提前筛选而制造的扩增培养基具有最大MSC扩增效率，而且不会损害MSC的多能性。
骨髓间充质干细胞或者骨髓基质细胞（MSCs）是具有多种系潜能的成人干细胞，它们便于基因改造并且具有免疫抑制能力。它们用途广泛，为组织工程学，再生医学和免疫疗法带来希望。包括骨髓，骨膜，骨小梁，脂肪组织，滑膜，骨骼肌和乳牙在内的许多组织都有MSCs。
它们能分化为骨，软骨，肌肉，骨髓，腱，脂肪和结缔组织。怀着对在体和体外实验深入研究的希望，我们有兴趣优化培养和扩增MSC的培养条件，同时保留MSC的多能性和分化能力。
为了评估不同来源和浓度的血清对MSC扩增的影响，我们用市上分化试剂盒和组分严格地测试了每种FBS对最大扩增潜能，维持hMSC表型特性和扩增的MSCs分化为脂肪细胞，骨细胞，软骨细胞的影响。我们通过对FBS的筛选开发了StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基。
我们的研究强调使用商品化产品的优势。为了hMSCs的研究，这些商品化的产品都已经被改善，优化，并且进行了检测。
材料和方法
人MSC 的培养。人MSCs （hMSCs ） 购于Cambr e x （ Lonz a ,Walkersville），先根据供应商的说明书培养，然后用StemXVivo人/小鼠骨髓间充质干细胞扩增培养基（ 目录# C C M 0 0 4 ； R & DSystems，Minneapolis）培养。
为了测试不同批次FBS的扩增潜能，每种F B S 以终浓度为1 0 % 或2 0 % 加入含有谷氨酰胺， 丙酮酸钠（ I r v i n e S c i e n t i c ， S a n t a A n a ） 的α - M E M 培养基（Invitrogen，Carlsbad）。
将1.25×105量级的hMSCs接种于一个T75长颈瓶，在细胞汇聚之前让细胞生长3至4天。在培养期末，培养于不同条件的hMSCs同时用胰蛋白酶/EDTA溶液收集。对细胞计数，并且用下面的公式计算扩增倍数。重新培养时，将1.25×105量级的hMSCs接种于一个新的T75长颈瓶，并用适当的培养基培养。每次传代后对细胞进行计数。
流式细胞术。hMSCs的收集如上所述。细胞用2×冷FACS缓冲液冲洗（含有2%FBS和叠氮化钠的PBS），然后以每毫升106量级细胞的密度重新悬浮于FACS缓冲液中。
2至8℃下，1×105量级的hMSCs用PE连接的单克隆抗体或者同型对照孵育45分钟。被染的细胞用2×冰冷FACS清洗，然后用FACSCalibur（BD Biosciences, SanJose）获取数据，用CellQuest软件（BD Biosciences）分析数据。
免疫细胞化学。人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒（ 目录#SC006, R&D Systems）的内单上有详细步骤。简而言之，室温下用含有4%多聚甲醛的PBS固定培养于盖玻片上的细胞20分钟，然后室温下用含有10%标准驴血清，0.3%Triton X-100和1%BSA的PBS封闭45分钟。
封闭后，在2至8℃下用稀释的一抗孵育细胞过夜，然后在室温下的暗室中用NorthernLights-557连接的二抗孵育细胞一个小时。每一个步骤间，细胞用含有0.1%BSA的PBS清洗三次。
成脂分化。按人骨髓间充质干细胞功能鉴定试剂盒的说明书诱导hMSC分化为脂肪细胞，骨细胞或软骨细胞。简而言之，准备完全成脂分化培养基和带有无菌盖玻片的24孔组织培养皿，将5 mL α-MEM基础培养基中3.7×105量级的hMSCs植入培养皿的十个孔中。
37℃下，培养皿在含有5% CO2的增湿孵化器中孵育，第二天细胞会汇合，弃掉培养基，然后加入0.5 mL的成脂分化培养基。每3至4天更换一次分化培养基，7天后脂肪细胞可见。第21天固定脂肪细胞，然后用免疫细胞化学技术鉴定。
成骨分化。用StemXVivo人/小鼠成骨基础培养基（目录#CCM007；R&D Systems）和StemXVivo人成骨补充剂（目录#CCM008；R&DSystems）诱导hMSCs分化为骨细胞。将0.5 mL完全成骨基础培养基中7.4×103量级的hMSCs植入含有无菌盖玻片的24孔培养皿的每个孔中。
37℃下，培养皿在含有5% CO2的增湿孵化器中孵育1至2天，直至50%至70%的细胞汇合，然后用0.5 mL的完全成骨分化培养基替换每个孔中的培养基。每3至4天更换一次分化培养基，14天至21天期间骨细胞可见。用免疫细胞化学技术鉴定分化的骨细胞。
录#CCM006；R&D Systems）诱导软骨细胞分化。
简而言之，将2.5×105量级的hMSCs移入一个含有5 mL预热完全成软骨基础培养基的15 mL锥形管中，然后200×g离心5分钟。将hMSCs重悬于0.5 mL预热的完全成软骨分化培养基中，然后200×g离心5分钟。
不破坏管底形成的细胞团，旋松锥形管的盖子让气体交换，然后37℃下，在含有5% CO2的增湿孵化器中直立孵育。每2至3天更换一次分化培养基，14天至21天后收获软骨细胞团。对软骨细胞团进行固定，切片，然后用免疫细胞化学技术分析。
结论
1. 通过对FBS的来源，批次和浓度的严格检测，我们鉴定一系列MSC培养基的效果。我们利用这些数据开发了人/小鼠StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基，该培养基优于其他市上扩增培养基。
a．对比于领先的竞争者的扩增培养基，StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基使hMSC更高倍地扩增。
b．用StemXVivo骨髓间充质干细胞扩增培养基培养扩增的hMSCs保有MSC表型，表现为具有关键的MSC标识物CD105和CD90，并且没有CD34。
c．扩增的hMSCs保有成脂分化，成骨分化和成软骨分化的全部潜能。
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