皮肤干细胞的扩增及定向诱导分化

皮肤干细胞的扩增及定向诱导分化

皮肤作为人体最外层的防御系统，具有极强的修复和再生能力。尤其是表皮，由多层角质细胞构成，其基底层存在着对皮肤再生、损伤修复起决定作用的干细胞群，称为表皮干细胞(epidermal stem cell)。它可通过对称分裂或非对称分裂的方式产生定向祖细胞即短暂增殖 (transient amplifying, T A ) 细胞(Jones etal.1993)，继而分化为表皮细胞、毛囊和皮脂腺。皮肤表皮干细胞这种特有的生物学特性，使之不仅对皮肤的动态平衡的维持发挥作用，而且对皮肤的损伤修复以及皮肤遗传性疾病、皮肤肿瘤等疾病的基因治疗具有十分重要的意义。

早期在对表皮细胞进行体外培养时，根据形成克隆的大小及其不同的增殖潜能，分为 3 种 类 型 ，包括来 源 于 表 皮 干 细 胞 的 Holoclone 和 来 源 于 T A 细 胞 的 meraclone、paraclone。尽管由此显示了表皮干细胞强大的增殖潜能，但对其分离鉴别仍存在限制。目前对表皮于细胞的体外分离方法主要有两种。一是选择特异的表面标志通过流式分选进行分离，如已发现的 P1 整联蛋白、 K 19、 K 1 5 等 ，由于它们并不能特异地代表表皮干细胞的表达，因而应用受到一定的限制。P6 3 为 P5 3 家族成员之一，近年来研究发现 (MillsetaL 1999, Yangetal.1999)，它可将表皮干细胞和 T A 细胞很好地区分开来，因此作为表皮干细胞的筛选标志，其具有一定的特异性。此 外 ，^ Catenin 作为黏附连接的结构部
分 以 及 wingless/W n t 信号通路的下游效应器，其磷酸化后在表皮干细胞的表达水平远髙T A 细 胞 ，因此也可作为一种区分标志。二是利用其对基底膜具有快速黏附的特性进行初步筛选，再根据其克隆形成能力进行单克隆培养。下面就以两种方法相结合，介绍人表皮干细胞的分离培养、鉴定及分化(Jiaxi et al.2004)。

主 要 设 备 与 试 剂

流式细胞仪、 D M E M 、 H a m F -12、 F B S 、 E G F 、转铁蛋白、腺嘌呤、胰岛素、霍乱毒素、氢化可的松、鼠 P1 整联蛋白-F I T C 单抗、鼠 IgG-F I T C 抗体、 P6 3 抗体、外皮蛋白抗体、 nestin 抗体、磷酸化在 Catenin 抗体、牛血清白蛋白。

方 法

人 胎 儿 基 底 角 质 细 胞 的 分 离 培 养

⑴ 取 胎 儿 全 层 皮 肤 ，用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% 的 E D T A 4℃ 过夜消化。

(2) 接种于丝裂霉素 C 处理过的N I H 3T 3 细胞滋养层上，加入下述培养基。培养基组成： D M E M 和 H a m F -12(3 : 1)、 1 0 % F B S 、 20ng/m l E G F 、 5 ug/ml转铁蛋白、 1.8xl0^-4m ol/L 腺嘌呤、 5ug/ml 胰岛素、 10^-10mol/L 霍乱毒素、0.4ug/ml 氢化可的松。

(3) 置 于 37℃ 、 5 % C O 2、饱和湿度的孵箱内培养。

⑷ 每 2 天 换 液 1 次 。

(5) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.02% E D T A 去除滋养层细胞后，胰蛋白酶- E D T A 消化传代。

流 式 细 胞 仪 分 选 标 志 细 胞

⑴ 取 传 1 代的角质细胞，用 1 % B S A 清洗。

⑵ 加 入 1 % B S A 及 F I T C 标记的 Pi 整联蛋白抗体， 3 7℃孵 育 lh。

⑶ 1 % B S A 清 洗 3 次 。

⑷ 用 70 哗 的 细 胞 筛 网 过 滤 。

(5) 加 入 PI(l( ag/ml) 染色液， 4 1 避光保存 30 min。

(6) 上流式细胞仪进行分选。

免疫荧光检测

(1) 细 胞 用 4 % 多聚甲醛室温固定 lh。

⑵ P B S 洗 3 次。

(3)用 Triton X-IOO 处理 lOmin。

⑷ P B S 洗 2 次。

(5) 加入一抗室温过夜孵育。

(6) P B S 洗 3 次后，加 人 F I T C 标记的二抗， 3 7 ^ 孵 育 45 min。

(7) P B S 洗漆后，加 入 pi，室温孵育2 min。

(8) P B S 清 洗 ，共聚焦显微镜观察。

电 镜 观 察

经流式分选出的细胞用戊二醛固定，行常规脱水、浸透及包埋后，透射电镜下观察。

分 选 出 的 表 皮 干 细 胞 的 培 养

(1) 分选出的表皮干细胞以 IO5个/孔的细胞密度接种于铺有 I V 型胶原 (100ug/ml) 的2 4 孔板中。

(2) 加入上述培养基，置 于 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度的孵箱内培养。

(3) 每 2 天 换 液 1 次 。

(4) 镜下观察细胞形态。

细 胞 克 隆 形 成 能 力 的 测 定

(1) 将分选的细胞接种于6 孔板上，密 度 为 1000个细胞/孔 (6 孔板用前 24 h 铺上用丝裂霉素 C 处理过的滋养层细胞)。

⑵ 加 入 上 述 培 养 基 ，置 于 3 7 ℃ 、 5 % C 0 2、饱和湿度的孵箱内培养。

(3)每 2 天 换 液 1 次 。

⑷ 培 养 2 周 后 ，细胞用福尔马林固定。

(5) P B S 清 洗 ， 1 % 罗丹明染色。

(6) 镜下计数克隆数，每个克隆至少包括 3 2 个细胞。克隆形成率(％)(C F E )=克隆数/接种细胞总数 X 100。

悬 浮 诱 导 终 末 分 化

⑴分选细胞置于上述培养基中，包 括 1.6% 甲基纤维素。

(2) 37℃ 培 养 2 他 后 ，收集细胞进行免疫组化分析。

(3) 细胞用甲醇和丙酮 (I : 1)的混合液室温固定 lOmin。

⑷ P B S 清 洗 3 次。

(5) 加 入 一 抗 代 过 夜 孵 育 。

(6) 下述步骤同 2.3 免疫炎光检测。

结 果

胎 儿 基 底 角 质 细 胞 的 培 养

在分选胎儿 (大于2 0 周龄) 基底细胞时，其表皮很容易从真皮层分离。对于更小胎龄的胎儿，由于分离不彻底，因此很容易混杂真皮成纤维细胞。而污染的成纤维细胞在培养时可阻止角质细胞的生长。分离的胎儿角质细胞在丝裂霉素 C 处 理 过 的 N I H 3T 3 细胞滋养层上生长良好，并 可 形 成 3 种类型的克隆，即 holoclone、 meraclone 和 paraclone。大部分克隆为 holoclone，具有高度的增殖潜能。同时在克隆中央有一些分层的细胞。培养 2 周后，来源于不同胎儿的角质细胞在形态和增殖潜能上无明显差别。

流式分离表皮干细胞

根据 P1 整联蛋白表达的高低，经流式分选出的细胞中的 P1 整联蛋白表达量最高的一群细胞定义为表皮干细胞，而另一群 P1 整联蛋白表达量较低的细胞定义为 T A 细胞。

表 皮 干 细 胞 的 分 子 标 志

为了对分选出的各类细胞进行鉴别，采用免疫荧光的方法对人表皮干细胞的表面标志进行检测。结果发现分选出的细胞中都髙表达口! 整联蛋白和磷酸化的P_catenin。而尸纪在定义的表皮干细胞的细胞核中有表达，表明这类细胞即为表皮干细胞。

表皮干细胞的形态

电镜下，分选出的表皮干细胞核大，胞质少，胞质细胞器较少，表明这群细胞具有原始细胞的特征。而 T A 细胞核小，胞质比例较大，胞质细胞器也相应较多。

表 皮 干 细 胞 的 增 殖

当表皮干细胞接种于铺有 IV 型胶原的孔板后，9 5 % 的细胞在20 min 内黏附于孔板底部 。开始表皮干细胞生长缓慢， 6 天 后 ，其增殖加速， 1〇天后细胞融合。而 T A 细胞则在 7 天内达到融合。表明干细胞进入增殖周期较了入细胞慢。

表 皮 干 细 胞 的 集 落 形 成 能 力

縛 14 雜 ，财 辦 赚 自 ，通 賊 克 麵 。经统计细胞的克隆形成率为(35. 6±5. 4) % ，而 T A 细 胞 的 克 隆 形 成 率 为 (4 訊 1)%。表月分选出的表皮干细胞比 T A 细胞具有更强的增殖能力。

表 皮 干 细 胞 的 终 末 分 化

分选细胞置于含有1. 6% 甲基纤维素的培养基后培养。外皮蛋白，标志着分选细胞向角质细胞的终末分化。

注 意 事 项

表皮干细胞的鉴别主要是根据其表面标志和克隆形成率这两个参数进行的。该方法所获得的胎儿表皮干细胞的克隆形成率较报道的略低，分析可能是因为分选效率或胎儿和成人口: 整联蛋白的表达存在差别所致。总之，由于目前并未寻找到皮肤干细胞表达的特异性标志，因此对其分离、纯化的技术手段及体外诱导分化的各种培养体系尚不成熟，有待于进一步研究