造 血 干 /祖 细 胞 的 体 外 分 化

造 血 干 /祖 细 胞 的 体 外 分 化

造 血 干 /祖 细 胞 向 红 系 定 向 诱 导 分 化

造血干/祖细胞具有极强的自我更新及向各系血细胞分化的能力。在体外要促使造血干/祖细胞向红系细胞分化，需要尽可能模拟体内的微环境。本实验室采用两阶段诱导的方法，获得了以晚幼红细胞为主的红系细胞。体 外 诱 导 分 化 的 14〜 2 1 天为细胞生长峰期，细胞总数可增加 1028.6±228.4(n=10) 倍，红系的诱导效率可达 (52.3±12.4)%。尽管实验表明造血干/祖细胞很容易分化为红系细胞，但在体外却很难实现分化细胞的成熟脱核。最近有研究结果显示，如果以减少扩增的细胞数为代价，也可能获得成熟
的红细胞 (Carlile et al. 2004)。而如何大规模的生产成熟的红细胞以满足临床输血需要这一问题就成了一个难题。 Giarratana 等研究人员 (2005) 提出了一个改进的技术方法，即通过尽可能的模拟骨髓微环境 (应用细胞因子及与基质细胞共培养) 的方法实现了造血干祖细胞的持续扩增及 1 00% 的分化为成熟的红细胞。这种方法适用于骨髓、 G-CSF动员的外周血、脐带血来源的造血干/祖细 胞 ，也适用于胚胎干细胞分化的红系祖细胞
(Carotta et al.2004)

材料和试剂

成人骨髓基质细胞或小鼠基质细胞系；

IMDM;

氢化可的松；

造血生长因子S C F 、 IL-3、 E P O 等 ；

B S A ;

转铁蛋白；

硫酸亚铁；

硝酸铁；

胰岛素；

PBS缓冲液；

FITC-C D 7 1 单克隆抗体；

核 酸 染 料 L D S - 7 5 1 ;

台 盼 蓝 染 液 ；

吉姆萨染液；

离 心 管 、吸管、培养板等。

CD34+造血干/祖细胞的分离纯化

见本节第一部分。

CD34+造血干/祖细胞向成熟的红细胞分化 (分三阶段进行诱导分化）

1 ) 第一阶段 (〇 〜 8 天）
(1) 按 IO⁴ 个/m 2 的密度接种C D 34⁺ 细胞于无血清培养液中，并 添 加 l0^-6 m 〇 I/L 氢化
可的松， SCF 100ng/m l ， IL-3 5ng/m l ， E P O 3IU/ml。将细胞置于 5 % C 0 2、饱和湿度的37℃孵 育 箱 中 培 养 。

无血清培养液： I M D M 、 1 % B S A 、转 铁 蛋 白 120ug/ml、硫 酸 亚 铁 900ng/ml、硝酸铁 9 〇 ng/ml、胰岛素 lOug/ml。

(2) 培养至第 4 天 ，将上述培养的细胞按 1 :4 传 代 ，培养条件不变。

2 ) 第二阶段 ( 3 天）

⑴ 基 质 细 胞 的 培 养 (见 4.1.2.2 中 步 骤 「 3) 细胞培养」）。

(2) 将第一阶段培养的细胞按 5xl 〇⁴ 个/ml、 2XlO
⁵ 个/ml、 3xl0⁵ 个/m l 的密度 (分另崃
源于脐带血、骨髓、外周血) 接种于预先铺有基质细胞层(M S - 5 或成人骨髓基质细胞) 的培养瓶里，在 含 有 3 IU/ml E PO 的无血清培养液中继续培养 3 天 。

3) 第三阶段 (10 天）

经上一阶段的诱导分化后，去除细胞因子，添加无血清培养液，使造血细胞继续与基质细胞共培养 10 天 。

4 ) 检测

(1)对诱导分化不同天数的细胞进行吉姆萨染色，观察胞核形态变化；并利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。

⑵ 细 胞 表 面 标 志 分 析 ：
a.收集分化不同天数的细胞，用 P B S 洗涤细胞。
b. 将 FITC-C D 7 1 单克隆抗体或 FiT C -IgG1 抗体 (作为阴性对照伽入 p B s 悬浮的细胞中，冰上孵育 30 min。
c.用 P B S 洗 涤 细 胞 3 次 。
d. 用核酸染料 LDS-751 对细胞染色。
e. 用 PBS洗涤 细 胞 3 次 。
f. 将细胞重悬于5000 PB S 中，用流式细胞仪检测。

(3) 血红蛋白分析，变形能力检测及体内实验验证等可参考文献报道 (Giarratana et al.2005)。

5 ) 结果
造血干细胞经细胞因子及基质细胞的共同诱导分化后，其细胞数量可扩增 1.95xl0⁶ 倍 ，分 化 第 15——18 天 ，细胞核开始消失，细胞表面的转铁蛋白受体 C D 7 1 逐渐丢失，造血 干 细 胞 100% 分化为成熟的有功能的红细胞。这些分化的红细胞具有天然红细胞的功能特点，如细胞膜变形能力、携氧能力等。

造 血 干 /祖 细 胞 向 巨 核 细 胞 定 向 诱 导 分 化

Sui 等 (1999) 的研究表明， C D 34⁺ 细胞可被分为两个细胞亚群： IL-6R⁺ 和 IL-6R^- 的细胞 。 IL-6R⁺ 细胞能被刺激而形成粒-巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞；而 IL-6FT 细胞当被给予 IL-6 河 溶 性 IL-6 受体 (SIL-6R ) 时则可形成红系及巨核系细胞，从而得出结论，即巨核系祖细胞存在于 IL-6R -的细胞群中。我们实验室利用上述特点采用免疫磁珠两步分离法
建立了一种巨核系祖细胞的分离方法。用 该 方 法 分 离 获 得 的 细 胞 在 体 外 加 入 T P O 、SIL-6R 、 S C F 等细胞因子组合培养 14 天后， C D 41/C D 6 1 双阳性细胞可达 6 0 % 以上 (以往的方法为 3 0 % 左右)，大大增加了巨核细胞的诱导效率，为该方案的临床实施奠定了基础。

材料和试剂

①脐带血、外周血或骨髓；

② MACS 磁性分离仪、分离柱；

③ MACS磁性细胞分离试剂盒 ( Lin^- 细胞分选、 CD126⁺ 细胞分选)；

④ P B S 缓冲液；

⑤甲基纤维素；

⑥ B S A ;

⑦ EDTA;

⑧淋巴细胞分离液；

⑨ IMDM;

⑩ SCF、 TPO、 IL-6、 SIL-6R 等 ；

⑪ 胰岛素;

⑫ 转 铁 蛋 白 ；

⑬ A 巯基乙醇；

⑭ L -谷氨酰胺；

© 叶 酸 ；

⑭ 维 生 素 B 12;

⑫ 瑞氏染液;

⑬ P E -C D 41、 FITC-C D 6 1 鼠抗人单克隆抗体；

@ 离 心 管 、吸管、培养板等。

Lin^- 细胞的分离

参 考 「Lin^-CD34^-细 胞 与 Lin^-CD34⁺细胞的分离」中的内容。

Lin^-/CD126^-细胞的分离

巨核系祖细胞的分离纯化， Backman Coulter 公司免疫磁珠分离系统。

(1) 取 抗 C D 126 抗体 (抗 IL-6 受体的抗体) 工作液 5 0 0 与 5 0 0 免疫磁珠混勻， 4℃孵育 30 min。

(2) 将分离的 L in^- 细胞与上述混合物混匀， 孵 育 30 min。

⑶ 将 细 胞 与 抗体的混合物置于5m l分离管内，充分混匀，置 于 Backman Coulter 磁架上室温静置，直到磁珠贴于磁场一侧、试管内液体清亮为止。

⑷在磁场内轻轻将液体吸出，其中的细胞为 Lin^- CD126^- 田胞。

(5) 贴于管壁的细胞即为Lin^- CD126⁺细胞。

(6) 将收获的 Lin^-CD126^-田胞加 PBS 缓冲液混匀，用于细胞计数及巨核细胞的定向诱导分化。

向巨核细胞定向诱导分化

1.配制诱导分化液
诱导分化液： I M D M 、 S C F 100ng/ml、 T P 0 4U /ml、 IL-6 100ng/mI、 sIL-6R 200ng/ml、
2 % B S A 、胰 岛 素 l 〇 ug/ml、转 铁 蛋 白 200ug/ml、β-巯基乙醇 0.01 mmol/L 、 L -谷氨酰胺2m g /ml、叶酸 50ng/ml、维生素 B ₁₂50ng/ml

2.细胞接种
将分离得到的Lin^-/CD126^-细 胞 按 2x l 〇 ⁴个/m l 的浓度接种于 2 4 孔板中，在 37℃：、
5 % CO2 及饱和湿度的培养箱中培养 14 天。设 Lin^-/CD126⁺细胞作为对照组。

3.细胞收集及分析
每 3 天半量换液。第 7 天 及 第 14 天收集部分细胞用于细胞计数及巨核细胞表型分析。

4.结果检测

(1) 细胞表面标志分析：
a. 先 用 PBS 缓冲液对收集的细胞进行洗涤。
b. 将 PE-CD4 1 ， FITC-CD6 1 单 克 隆 抗 体 加 入 P B S 悬浮的细胞悬液中，以加入PE-Ig G l 及 FITC-Ig G l 标记的抗体的细胞作为阴性对照。冰上孵育 3 〇 min。
c.洗涤细胞，流式细胞仪检测。

(2) 细胞形态学分析：常规瑞氏染液染色，普通光学显微镜下观察并摄片。

5.结果
对 分 离 Lin^-细胞前后的细胞进行计数，可 统 计 出 Lin^-细 胞 占 M N C 的比率约为(0.66±0.33)%(« = 6)。通过流式细胞仪分析， IL-6R^-细 胞 占 Lin^-细 胞 的 3 2 % 〜 4 3 % 。由此方法可从一份胳带血中分离出巨核系祖细胞 (Lin_CD126-细胞) 约 (8.32±2.17)x l 〇 5 个 (该方
法已申报国家发明专利，授权号： ZLOl 120150.9)。 Lin^-/CD126^-细胞在 IL-6/SIL-6R 等的作 用 下 ，使 其 细 胞 总 数 在 培 养 的 第 7 天可扩增 35.2±2.8 倍，培 养 至 1 4 天时可扩增94.5±13.0 倍，流式细胞仪检测结果表明 CD4 i a⁺/CD61⁺细淑巨核系细胞) 比例可达 6 7 % (图
4.1)。与 Lin^-CD126⁺ 细胞相比，无论在细胞扩增的倍数上，还 是 在 CD41a⁺ /CD61⁺ 广细胞所占的比例上， Lin^-/CD126^- 细胞组均优于 Lin^-/CD126⁺细胞组 (P<〇. 〇 5)。形态学观察可见典型的巨核细胞 (图 4.2)。

造 血 干 /祖 细 胞 向 粒 系 定 向 诱 导

分化尝 试 诱导造血干 /祖 细 胞向粒系细胞分化 ，不但可以为临床成分输血提供大量的粒细 胞 ，还可以为对分化过程中的分子调控机制的进一步研究提供一个很好的模型。本实验室根据不同细胞因子的作用，摸索出利用
S C F +IL-6+IL-3+G -C S F 的组合，可以诱导脐带血造血干/祖细胞向粒细胞分化，分化效率达 6 4 % 。出于临床应用的考虑，我们利用混合脐带血浆代替了常规造血细胞体外培养所应用的牛血清及马血清，获得了满意的结果 ，其意义在于一方面节约了应用成本，另一方面则避免了由于异种血清造成的免疫反应。

1.材料和试剂

I M D M ;

胎牛血清、马血清；

S C F 、 IL-3、 G -C S F 、 IL- 6 等 ；

P E -C D l l b 、FITC-C D 1 6 鼠抗人单克隆抗体；

大 肠 杆 菌 J M 1 0 9 ;

L B 培养基；

生理盐水；

甲醇 ；

台盼蓝；

瑞氏染液；

碱 性 美 蓝 液 。

2.CD34⁺ 造血干/祖细胞的分离纯化
参见本节第一部分。

3.向粒系细胞定向诱导分化

⑴将分离得到的造血干/祖细胞按 2xl0⁵ 个/m l 的密度种入 2 4 孔板中，添加培养液：I M D M 培养基含 1 5 % 胎牛血清及 1 5 % 马血清。培养体系中加入以下 4 种细胞因子:50ng/m SCF、 2ng/mlIL-3、 40ng/mlG-CSF、 20ng/mlIL-6。将细胞置于 37℃ 、 5%CO2 及饱和湿度的培养箱中培养。

(2) 每 2 天加细胞因子一次，每周半量换液。

(3) 经第一阶段培养 7 天后，细胞因子改为每 2 天只加一次 40ng/ml G -C S F 。

(4) 每 2 天取样品对有核细胞进行计数，并利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。

(5) 检测。

a. 细胞表面标志分析：
i. 收集细胞，用 P B S 缓冲液洗涤细胞。

ii. 将 PE -C D l l b ， FITC-C D 16 单克隆抗体加入 P B S 悬浮的细胞悬液中，以添加PE-IgGl 及 FITC-IgGl 抗体的细胞作为阴性对照，冰上孵育 30 min

iii.用 P B S 缓冲液洗涤细胞以去除未结合的抗体，重悬细胞后上流式细胞仪检测。

b. 细胞形态学分析：常规瑞氏染液染色，普通光学显微镜下观察并摄片。
c. 粒细胞吞噬细菌功能测定：
i.将大肠杆菌 J M 109 接种 于 L B 培养基中，放 3 7℃摇床振荡培养 4 h 左右。

ii. 将上述菌液置水浴中 (I O O ℃ 伽 热 IOmin，目的是杀死细菌。
.
iii. 用无菌生理盐水稀释成 6x IO⁸ 个/m l 备用。

iv . 取诱导分化的粒细胞按IxlO⁸ 个/m l 浓缩。

V. 取 5 〇 ul 细 胞 悬 液 ，加人洁净凹玻片的凹孔内，轻轻搅动混勻，再加上述菌液 20 ul 充分混匀。

Vi.置入铺有湿纱布的有盖容器内 (此容器先放 37T 温箱中预温)，在 3 7℃ 温箱中作用 30 min，其 间 每 隔 IOmin 摇匀一次。

vii.作用完毕，取 1 滴混合液置于洁净无油污的载玻片一端，推成薄片。

viii. 待干后，用甲醇固定 4——5 min，碱性美蓝液染 2〜 3 min，置油镜下观察。

ix. 随 机 计 数 100 个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的白细胞数，对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数，将 1 0 0 个中性粒细胞吞噬的细菌总数除以 100, 得到每个白细胞吞噬细菌的平均数，即为吞噬指数。

(6) 结 果 ：本实验室的结果显 t k 体 外 诱 导 分 化 的 14〜 2 1 天为细胞生长峰期，细胞总数 可 增 加 l 〇〇 6.4±103.2(n = 10) 倍 ，随着培养时间的延长，细胞数量不再增加而死细胞的比率开始增加，死细胞比率达到 2 0 % 的时间为 33.0±4.0 天 (n= 1〇 )。利用粒系的特异性表面 标 志 C D l l b 进行流式细胞仪检测，结果表明粒系的诱导效率可达 (64.7±10.3)%。显微镜下可见典型的粒系细胞，其中可见许多分叶核细胞 (图 4.3)。诱导分化的细胞与大肠杆菌 作 用 30m i n 后 ，发生细菌吞噬的细胞为 35.0%，平均每个吞噬细菌的细胞内的细菌数为 5.0±3.0 个 (图 4.4)。

造 血 干 /祖 细 胞 向 树 突 细 胞 定 向 诱 导 分 化

树突细胞 (dendritic cell， DC) 是功能最强的抗原呈递细胞，它在机体免疫应答过程中发挥了重要的作用。为获得大量纯化的树突细胞以满足临床需要，人们尝试从骨髓、脐带血、脾脏、外周血等部位分离C D 34⁺ 造血干细胞、单核细胞并将其定向诱导分化为具有较强免疫功能的树突细胞

1.材料和试剂

I M D M 、 R /M I N I 1640;

胎牛血清；

F L 、 G M -C S F 、 IL-4、 TNF-Ot 等 ；

台盼蓝 ；

PE-CD1a,FITC-CD80(B7-1)及PE-HLA-DR鼠抗人单克隆抗体；

PBS

外周血 ；

T 细胞尼龙毛柱；

淋巴细胞分离液；

丝 裂 霉 素 c ;

[³ H]-TdR;

液 闪 计数 仪 ；

离心管、吸管、培养板等。

2.C D 34⁺ 造血干/祖细胞的分离纯化
参见本节第一部分。

3.向树突细胞定向诱导分化

⑴将分离得到的造血干/祖细胞按 2xl 〇 ⁴ 个/m l 的密度种入 24 孔板中，添加基础培养液:I M D M ±咅养基含 10% 胎牛血清。添加 4 种细胞因子:40ng/ml F L 、40ng/ml G M -C S F 、1000U/ml
IL-4、 50U /m l T N F -a 。将细胞置于 3 7 ℃ 、体积分数为 5 % C 0 2 的空气条件下培养 2 周。

(2) 每 2 天添加各种细胞因子一次，并取样品对有核细胞进行计数，利用台盼蓝染色计算出活细胞的比率。

⑶ 检 测 。

a. 细胞表面标志分析：
i. 收获诱导前后的细胞，用 P B S 洗涤。

ii.向细胞悬液中分别加入 PE-C D l a 、 FITC-C D 80(B 7-1) 及 PE-H L A - D R 鼠抗人单克隆抗体，以添加 PE-IgGl 及 FITC-IgGl 抗体的细胞作为阴性对照， 4℃ 孵 育 20〜 25 min。

iii. P B S 洗 涤 3 次 ，重新悬浮，用流式细胞仪检测。

b. 同种异体 T 淋巴细胞增殖反应：
i. 取 健 康 志愿者的外周血 10m l ，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集单个核细胞 (具体步骤参考本节第一部分)。

ii.将获得的 M N C 置 37T 、 5 % 0 ) 2 的培养箱中培养 2h。

iii. 去除贴壁细胞，非 贴 壁 细 胞 用 含 5 % 胎 牛 血 清 的 R P M I 1640 悬 浮 ，注 入 T细胞尼龙毛柱中， 3 7 ℃ 孵 育 lh
iv冲洗出非黏附细胞，用作同种异体 T 细胞，调整密度种人 9 6 孔板中 (IxlO⁵ 个/孔)。

V. 将 诱 导 I4 天的树突细胞与 3 〇 ng/m l 丝裂霉素 C 共 孵 育 30 min。

vi.P B S 缓冲液洗 3 次 。

vii。用含 10% 胎牛血清的 R P M I 1640 培养液悬浮诱导分化的树突细胞，调整密度后，加人预先种有 T 淋巴细胞 (IxlO⁵ 个/孔 ) 的 9 6 孔板中，使效靶比分别 为 1:1000, 1:100, 1 : 1 0 , 均 设 3 个复孔，终 体 积 为 200ul/孔 。

viii. 置 37℃、 5%C0 2 的培养箱中共培养 96h。

ix. 于培养结束前 16 h 加入 0.5 uCi/孔 (ICi = 3.7xl〇¹⁰ Bq) 的 [3 H]-TdR。

x. 收集细胞，液闪计数仪检测 c p m 值 ，结 果 用 3 孔均值表示。

(4) 结 果 ： D C 表 达 C Dla 抗原。本室 的 研 究 结 果 表 明 在 F L 、 G M -C S F 、T N F -Ot 及 IL-4 等细胞因子的诱导下，脐
血 C D 3 4⁺ 细 胞 可 分 化 形 成 大 量 的DC(CDla
⁺ )。 诱 导 培 养 2 周 后 ，可使CDla⁺ 细胞的比例增至 (27.18 土 1.56) % ，且培养细胞中可见大量的 D C (图 4.5)，其 中 GM-CSF 和 TNF-a 及 IL-4 是诱导生成 D C 的基本的细胞因子，SC F 和 F L 对诱 导 C D 3 4 ⁺ 细胞生成 D C 具有明显的协同 作 用 。 扩 增 后 的 细 胞 中 CDla⁺ 、C D 8 〇⁺ (B 7-l) 及 H L A -D R ⁺ 细胞的比例分别由扩增前的 (〇.65±0.38)%、（0.36±0.25)% 及 (2.39 土 0.27)% 增加至诱导分化后的(27.18±1.56)%、（22.2±2.23)% 及 (87.68±3.81)%。诱导分化的树突细胞对刺激同种异体 T细胞增殖具有很强的功能。