造 血 干 /祖 细 胞 的 扩 增
最新修订时间：
材料与仪器
步骤
造 血 干 /祖 细 胞 的 扩 增
基 质 细 胞 支 持 的 造 血 干 /祖 细 胞 扩 增
Dexter等 在 1977年建立了骨髓液体培养体系。此培养法的基础是建立骨髓基质细胞支持层 (包括成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和网状细胞等)，形成二维空间结构，该培养体系不但提供了营养、细胞因子，而且提供了类似于体内的细胞-细胞关系 ，通过模拟体内造血微环境，实现造血干细胞的长期培养。我们可以根据实验需要自行分离培养骨髓基质细胞，或购买已经建系的基质细胞，如 MS-5s HESS-5等 。
1.实验所需材料
成人骨髓或小鼠基质细胞系；
IM D M 、 α-M E M ;
马血清、胎牛血清；
β-巯基乙醇；
氢化可的松；
造血生长因子F L 、 S C F 等 ；
明胶；
胰酶；
离心管、吸管 、培养板等。
2.成人骨髓基质细胞的培养
(1) 取自无血液病或原发病未涉及骨髓的有核细胞，悬浮于长期液体培养体系(longterm culture medium， LTC-medium）中 ，种入 T-25 cm2组织培养瓶中 ，培养 3〜 4 周 ，每周半量换液，并洗去未贴壁细胞。
长期液体培养体系： I M D M 、 12.5 % 马血清、 12.5% 胎牛血清、10—4mol/L β-巯基乙醇 、 l06mol/L 氢化可的松。
(2) 待细胞生长至8 0 % 〜 9 0 % 汇合后，可收集基质细胞，冻存于液氮中。直至共培养一周前，复苏细胞。
(3) 在共培养之前的72 h ，用 15 Gy γ射线照射骨髓基质细胞。
⑷ 照 射 后 48 h ，用 0 . 2 5 % 胰酶消化细胞，并 以 6xl04〜 8xl04 个/m 2 密 度 接 种 于 24
孔板中，经 24 h 重新贴壁后即可用于共培养。
3.小鼠基质细胞系的培养(Is+saad et al.1993)
(1) 将 M S -5基质细胞系培养于添加了 10% 胎牛血清的a_M E M 培养液中。细胞生长汇合后，仍可以维持数周，不需要传代培养。
(2) 共培养前，为防止基质细胞提前脱落，可 预 先 用 1 % 明 胶 包 被 2 4 孔 板 ，随后将未照射的 M S -5细胞 按 4xl 〇 4个/m l 的密度铺于 2 4 孔板中。
4.共培养
(1) C D 34+造血干细胞的分离纯化 (见本节第一部分内容)。
(2) 按 2xl 〇 3〜 5xl03 个/m l 密度将造血干细胞接种于预先铺有基质细胞的2 4 孔板中，添加长期液体培养体系，或添加造血生长因子如F L 、 S C F 等。
(3) 将细胞置于 5 % C O 2, 饱和湿度的3 7 ¾ 孵箱中培养。每周半量换液。
(4) 每周做细胞计数，流式细胞仪检测C D 3 4 分子的表达情况及造血集落分析(具体步骤见下文) 等，以评估共培养体系对造血干/祖细胞的扩增效果。
细 胞 因 子 支 持 下 的 造 血 干 /祖 细 胞 扩 增
很多造血生长因子 (hematopoietic growth factor,H G F ) 对造血干/祖细胞的增殖分化都具有重要的调控作用。这些因子包括S C F 、 F L 、 IL-6、 IL-11、 IL-12、 LIF、 G -C S F 和 T P O等 。人们通过实验证明多因子组合对于造血干/祖细胞的扩增是非常必要的。但由于不同
来 源 、具有不同表面标志的分离的造血干/祖细胞对细胞因子的反应有所不同，而可扩增造 血 干 /祖 细 胞 的 因 子 又 很 多 ，所 以 人 们 尝 试 的 细 胞 因 子 组 合 也 比 较 多 。下述方案(Gammaitoni et al.2003) 是扩增造血干/祖细胞效果较好的方案之一。
1.准备以下材料和试剂
成人骨髓或小鼠基质细胞系；
I M D M ;
胎牛血清；
造血生长因子F L 、 S C F 、T P O 、 IL-6 等 ；
MethoCult™ G F +H 4435 培养基；
MyeloCult H 5100 培养基；
氢化可的松；
胰酶；
小鼠抗人C D 3 4 单克隆抗体；
离心管、吸管、培养板等。
2.CD34+ 造血干/祖细胞的分离纯化
见本节第一部分。
3.细胞培养
按 2x l03——5x l 〇3 个/m l密度接种 CD3 4+细 胞 于 2 4 孔板中，添加扩增培养液 (lml/孔)。
将细胞置于 5 % CO2, 饱和湿度的37℃孵箱中培养5 周 。
造血干/祖细胞扩增培养液： IMDM、 1 0 % 胎牛血清、 SCF 50ng/ml、 FL 50ng/ml、TPO 10ng/ml、 IL-6 10ng/ml
4.细胞计数及检测
每周半量换液。并做细胞计数，流式细胞仪检测C D 3 4 分子的表达情况等。
5.造血祖细胞集落分析
⑴ 配 制 培 养 体 系 ：自行配制，或使用公司提供的甲基纤维素培养基MethoCult™GF+H4435(Stem Cell Technologies)
甲基纤维素培养基： I M D M 、 1.0% 甲基纤维素、 3 0 % 胎牛血清、 1 % 牛血清白蛋白、lO-4nol/L β-巯基乙醇、 2 mmol/L 谷 氨 酰 胺 、 SCF 50ng/m l 、 GM-CSF 20ng/m l 、 IL-320ng/ml、 IL-6 20ng/ml、 G-CSF 20ng/ml、 Epo 3U /ml
(2) 接种扩增前的 C D 34+ 细胞 (IxlO3 个/ml)、扩增后的细胞 (5xl04 个/ml), 于 5 % C 0 2、
饱和湿度的37¾: 孵箱中培养 2 8 天。
(3) 在 培 养 14〜 2 1 天时，对集落形成单位总数(total colony forming unit in culture,C F U -C ) 进 行 计 数 ，包 括 粒 -巨 嗤 细 胞 集 落 形 成 单 位 (cl 〇 ny forming unit-granulocyte/macmphage， C F U -G M ，在 20x解剖显微镜下检测半透明细胞数多5 0 的集落数)，红系爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroid， B F U -E ) 和多系或混合集落形成单位(clony
forming unit-mix , clony forming unit-granuloid/erythroid/macrophage/megakaryocyte ,C F U -Mix/C F U -G E M M )，在 第 2 8 天 计 数 高 增 殖 潜 能 集 落 形 成 单 位 (high proliferativepotential-colony forming unit， H P P -C F U X 检测细胞数>50 000、直径>0.5m m 的致密大集落)。
6.LTC-IC (long term culture initiating cell) 分析
⑴ 骨 髓 基 质 细 胞 的 培 养 ：见 步 骤 「3) 细胞培养」。
⑵贴壁骨髓基质细胞铺满瓶底后，用 15 Gy γ 射线照射细胞。
(3) 用 0.25% 胰酶消化细胞，并 以 7x l 〇 3 个/cm2 的密度接种于 2 4 孔板中，经 24〜 48 h重新贴壁后即可用于共培养。
(4) 向已铺好基质细胞层的孔中加入扩增前的细胞 5x l03 个 或 扩 增 后 的 细 胞 IxlO3个 ，培养液可选择 MyeloCult H5100(Stem Cell Technologies) , 并添加 10-6mol/L 氢化可的松。每周半量换液。
(5) 培 养 5 周 后 ，用 0 . 2 5 % 胰酶消化细胞，收集所有细胞洗涤 1 遍后，按上述集落培养方法进行造血细胞集落分析，第 14 天对所有集落进行计数，即为 LTC-IC。
7.结果
纯 化 的 CD34+细胞在体外扩增培养体系中培养 14 天后，细胞总数、 CD34+及 CD34+CD38- 亚群均有不同程度的扩增。培养 至 第 8 周 ，成人骨髓来源的造血干/祖细胞可扩增90〜 10 000 倍 。扩增后的细胞具有很好的集落形成能力。培 养 至 第 10 周时成人骨髓来源的造血细胞的集落形成细胞总数扩增了 50〜 5000 倍 。LTC-IC 数量从培养第一周开始就有明显的增加，培 养第 4 周的细胞的 LTC-IC 可 扩 增 7.4 倍 ， 5 周 时 扩 增 11.3 倍 。
来源：丁香实验
