造 血 干 /祖 细 胞 的 分 离 纯 化

造 血 干 /祖 细 胞 的 分 离 纯 化

分离造血干细胞的常用技术是利用细胞的表面标志进行磁性激活的细胞分选 (magnetic activated cell sorting， MACS)。在造血干细胞的众多表面标志中， CD3 4 是最常用的标志性分子， CD34 分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，在造血干细胞、一部分造血祖细胞、血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面表达。虽 然 CD34⁺细胞不全是造血干细胞，但是所有的造血干细胞均应表达 CD34 分子，所以临床和基础研究多是基于对 CD34⁺细胞的筛选来富集造血干/祖细胞的。近年来应用胎羊免疫缺陷小鼠移植模型进行的相关研究表明，将一群不表达 CD3 4 分子的 Lin_CD34-细胞移植到条件受者后，也能重建接受者的长期多系造血及免疫功能。这 群 LirTCD34-细胞是比 CD34+造血干细胞更原始的前体细胞。本实验室已经建立了两步法负性筛选 LirTCD34-细胞 (白慈贤等 2003) 及 正 性 筛 选 CD34⁺细胞的技术。此外 ， CD133 分子 (Miraglia etal.1999)、 KDR 分子 (Ziegler etal.1999) 等也被用来分选造血干细胞，其分离步骤与 CD34+细胞分选步骤基本相同，这里就不详述了。

免 疫 磁 珠 方 法 分 离 C D 34⁺细胞

MACS 是 2 0 世 纪 9 0 年代初兴起的一种分离细胞的新型技术，人们可以运用该技术在短时间内 ( < 2 h)高 效 分 离 CD34⁺细胞。整个分离过程依赖于一个可以特异性识别造血干/祖 细 胞表面CD34 抗原的抗体，该抗体与磁珠相连，当细胞群(与抗体、磁珠孵育后)通过磁场时，细胞-抗体-磁珠复合物就可以被磁场捕获，而阴性细胞群则会流出磁场。

1 ) 实验所需仪器及材料

调温低速离心机；

超净工作台；

二氧化碳孵育箱；

电子天平；

流式细胞仪 ；

普通光学显微镜；

MACS 磁性分离仪、分离柱；

MACS 磁性细胞分离试剂盒(抗 CD34 抗体、磁珠);

脐带血、外周血或骨髓;

PBS 缓冲液；

甲基纤维素；

BSA;

EDTA;

淋巴细胞分离液；

离 心 管 、吸管、培养板等。

2) 单个核细胞的分离(mononuclear cell， MNC)

⑴ 肝 素 抗 凝 的 脐 血 、骨髓或动员的外周血按 I : 1 的比例与P B S 混 匀 ，再 按 4 : I的比例与 0 . 5 % 甲基纤维素混匀，室温 静 置 30 min，待红细胞自然沉降至界限分明。

⑵ 吸 出 上 清 ，置 于 50m l 离心管中， 2 0 ℃ 、 1500r/min 离 心 5 min。

⑶ 弃 上 清 ，力口5 ml PBS重悬细胞。

⑷ 先 在 IOmI 离心管中加入 5m l人淋巴细胞分离液 (FicollHypaque 液)，再缓慢沿管壁 加 入 5m l 细胞悬液， 20℃ 、 1500r/min 离 心 20 min，可以看出液体由上至下分成PBS、MNC、 Ficoll-Hypaque 液 、红细胞共 4 层 。

(5) 收集界面单个核细胞，用 P B S 洗涤。

(6) 用 PBS悬浮细胞计数，备用。

3) CD34⁺细胞的分离纯化

(1) 用 3 0 0 0 分离缓冲液悬浮单个核细胞，分 别 加 人 CD34⁺细胞分离试剂盒中的试剂 A l(非特异性阻断抗体)、 A2(CD34特异性单抗QBEND-10)各 100 ul，轻轻混勻，冰上孵 育 20 min。
分离缓冲液： PBS、 0.5% BSA、 2 mmol/LEDTA。

(2) 力口500ul分离缓冲液， 4℃ ；3000r/m i n 离 心 3 min，弃上清。

(3) 用 400ul 分离缓冲液悬浮细胞，加入试剂B (结合50n m 磁 珠 的 IgG)100ul，轻轻混勻 ，冰上孵育 20 min。

(4)加500ul分离缓冲液， 4℃ ,3000r/min离心3分钟, 弃上清。

(5) 再 用 Iml 分离缓冲液重新悬浮细胞，制成单细胞悬液。

(6) 将分离柱固定于 M A C S 磁场内，用 2m l 分离缓冲液冲洗分离柱。

(7) 将单细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡；用 2m l 分离缓冲液洗涤。

(8) 将分离柱移出磁场，用 Im l 分离缓冲液加压洗脱，收 集 lin^-CD34⁺细胞的组分，进行细胞计数 ，备用。

4) CD34⁺细胞纯度的检测

(1) 取 IxlO⁵ 分 离 的 CD34⁺细胞， PBS离心洗涤后用1000 PBS重悬。

(2) 加 入 PE 标 记 的 CD34单克隆抗体20队 4 1 孵 育 30 min。

(3) PBS 洗 涤 2 次 ，重 悬 于 PBS， 流式细胞仪检测。

5 ) 结果
16份脐带血标本的体积、分离的单个核细胞及CD34+细胞数量等结果见表4.1(本实验室数据)。所采集的脐带血标本的体积和细胞含量有显著的个体差异。经 M ACS分离纯化后， CD34⁺细胞纯度可达 85%〜 98% 。

6 ) 注意事项

(1)注意无菌操作。

(2)收 集 的 脐 带 血 在 分 离 前 最 好 保 存 在 代 ，时间不超过 4 h 。

(3) 收集的骨髓细胞在分离前最好保存在4℃; 分选前，先将样品过30 Mm 的筛网以去除细胞团等。

(4) 收集的外周血在分离前最好保存在4°C ，时间不超过8 h 。

(5) 在分离单个核细胞前应尽量去除红细胞。

(6) 与 A l 、 A 2 、 B 试剂的孵育时间要充分，以使抗原抗体及磁珠能有效地结合。

(7) 在标记过程中，升高温度或延长孵育时间，可能会增加非特异性反应。

(8) 操作中，要避免细胞悬液中产生气泡，应尽可能使用脱气的分离缓冲液。

(9)如果样品中出现血小板凝集或血小板黏附在细胞上的情况，可通过低速离心(200s 离 心 IOmin)去除血小板。

Lin^- C D 3 4 ^- 细胞与 Lin^- C D 34⁺ 细 胞 的 分 离

根据造血干细胞的表面特征： CD34⁺、 CD3^- CD7^- CD8^- CDlO^- CD14^- CD15^-CD19⁺、 CD2 0 ⁺ CD33⁺(其中 CD10、 CD19、 CD20 是 B 淋巴细胞的标志， CD3、 CD7 、CD8 是 T 淋巴细胞的标志， CD14、 CD15、 CD3 3 是成熟髓细胞的标志)，可以通过去除成熟细胞的负筛选方法对造血干细胞进行富集。不想要的成熟细胞被相应的抗体和胶体磁珠颗粒标记，在通过磁场时与分离柱结合而被留在磁场内，收集流出液即为相对处于早期的干/祖细胞 (Lin^- 细胞)。 Lin^- 细胞可进一步用来筛选CD34⁺或 CD34^-田胞。

实验所需仪器及材料 ，

参 考 「免疫磁珠方法分离 CD34⁺细 胞 」 的内容。