间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增

间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增

研究表明，除骨髓外，在外周血、脐血、脂肪、关节滑膜以及骨骼肌和皮肤的结缔组织等多种组织中均发现有 M S C 的存在。骨 髓 中 M S C 的含量很低，一 般 为 0.001%〜0.01%，要 利 用 M S C 就必须实现其在体外的分离培养及扩增。目前，分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。下面分别介绍几种适用于不同来源的人的 M S C 的分离纯化及扩增方法。

骨 髓 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

1.材料与试剂
骨髓、低糖 D M E M (D M E M -L G ) 、 Percoll 分离液、 IOxPBS、 IxPBS、 MesenCult™培养液、肝素。

2.方法
(1) 无菌条件下采集健康志愿者骨髓，肝素抗凝。

(2) 用 含 10% 胎 牛血清的 D M E M - L G 培养液适当稀释样品， 1500r/min离 心 5 min,弃上清及脂肪层。

(3) 加 入 5m l 含 10% 胎牛血清的 D M E M - L G 培养液，混匀。

⑷ 按 照 I :1 的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为 l. 〇 73 g/m l 的 Percoll分离液中 ， 1500r/m i n 离 心 30 min。离心后管内容物分为 3 层 。上层为血小板，中间层为 Perc0Il分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。
1.073 g/ml Percoll 分离液配制方法： 5.4 ml Percoll 原液、 6m ll 〇 xPBS。 二者混匀后，吸 弃 3 0 0 ul混合液。然 后 用 IxPBS 补 齐 至 l 〇 m l， 即 为 1.073 g/ml Percoll分离液。

(5) 吸取云雾状单个核细胞层，加人培养液稀释混匀，离心洗涤 2 遍 。

(6) 用 MesenCult™ 培养液叹 6111 〇 611(：〇.) 重悬细胞，以 2.(^10⁵ 个/〇 112 的细胞密度接种于培养瓶中，置 于 3 7 1 、 5 % CO2、饱和湿度的孵箱内培养。

(7) 48 h 后弃掉未贴壁细胞，更换新鲜培养液。

(8) 以后每 3 天换液一次。

(9) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。

(10) 按 8xl 〇³ 个/cm2 的细胞密度传代进行扩增培养。

3.结果
用 Percoll液 (l. 〇 73 g/ml) 梯度离心从骨髓中分离单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中， 72 h 后出现散在的纺锤状贴壁细胞， 1 〇 〜 1 4 天后形成克隆， M S C 贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。约 3 周出现致密的贴壁细胞层，此时细胞的两极开始有规律地排列成束状 (图 4.6)，有的呈漩涡状 。每瓶单层融合的 M S C 用胰蛋白酶消化后平均获得 (5.5±0.17) XlO⁵ 个细胞，将这些细胞再传代培养，扩 增 I2 代后可获得 2.3xl 〇 ⁹ 个细胞，扩增约 4.6xl 〇 ⁴ 倍 。

4.注意事项

(1) 在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的 M S C 外 ，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的 M S C ，必须除去其他细胞。根据这些污染细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去; 对于贴壁细胞，可根据其黏附能力与 M S C 黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间，保 证 M S C 在短暂的时间内与培养皿底分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养皿底，从 而 使 M S C 得到纯化。

⑵选择合适贴壁时间的细胞。如果选用贴壁时间过早的细胞 (1〜 3 h)，则因贴壁细胞数量太少，使细胞生长困难；如果选用贴壁时间过长的细胞 (超过48 h)，在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上呈集落生长，随着培养时间的延长，会出现贴壁细胞形态多样性，细胞传代周期延长，细胞易老化等现象。

(3) 筛选最适于 M S C 生长的血清。首先血清的质量对于 M S C 的生长非常重要，一定要对不同批次的血清进行比较，筛 选 出 最 适 合 M S C 生长的一个批次。本实验介绍的MesenCult™ 培养細卩是选用了经过筛选的适于M S C 增殖的胎牛血清而配制的，通过传代 培 养 后 M S C 的纯度可高达 9 5 % 以上 (一代和二代扩增培养后的 M S C 的表型一致性分
别 达 到 9 5 % 和 98%)。其次，血清的浓度也很重要，并非浓度越高越好，反而高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，易引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一 般 以 5 % 〜 10% 胎牛血清最适合 M S C 生长。

(4) 选择合适的接种密度。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一’般适宜密度为 (4——8)xl 〇 ⁴ 个/ml(艾国平等 2001)。

脐 带 血 来 源 的 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于胳带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞 (Lingling et al.2003)。破骨样细胞多核，表 达 T R A P 、 C D 45、 C D 51/C D 6 1 ; 间充质样细胞呈成纤维样，表达 S H 2 、 S H 3 、 S H 4 、 A S M A 、 M A B 1470、 C D 13、 C D 29、 CD49e ，这与骨髓 M S C 完全一致。以下就将脐带血 M S C 的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血 M S C的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。

1.材料与试剂
肝素、脐血、 D M E M - L G 、 Ficoll-Hypaque 分离液、甲基纤维素、 IxPBS、 MesenCult™培养液。

2.操作步骤

(1) 无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血 50——100 ml。

⑵ 与 0.01mol/L p H 7.4 的 PBS 按 I : 1 混匀。

⑶ 再 按 4 : 1 的比例与0.5% 的甲基纤维素混勻，室温静置 30m i n 以沉降红细胞。

(4) 小心吸取上清，离心。

(5) 弃上清，用 P B S 重悬细胞。

(6) 叠加到密度为 1.077 g/ml 的 Ficoll-Hypaque 溶液上， 900 g 离心 20 min。

(7) 取界面层，加 入 P B S 混勻，离心洗涤。

(8) 用 MesenCult™ 培养液 (Stem Cell C o .) 重悬细胞，以 I. OxIO6 个/c m 2 的密度接种于培养瓶中，置 于 37℃ 、 C 0 25 % 、饱和湿度的孵箱内培养。

(9) 1 周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。

(10) 以后每 3 天 换 液 1 次。

(II) 细胞长到 8 0 % 融合时用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% E D T A 混合液消化传代，在显微镜下控制消 i 七时间。

(12) 以 8. 〇 xl 〇3个/c m 2 的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。

3.结果
以 Ficoll-Hypaque液梯度离心分离胳带血单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中 ， 一 周后全量换液，去除未贴壁细胞。有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞 ，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，内含多个核 (图4.7A)。间充质样细胞即为 MSC，胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成包含有几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖， 3 周后细胞生长达 80%——90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此 时 的 M SC 呈较均一的长梭形，形态类似于 骨 髓 MSC，但较骨髓 M SC 稍小 (图 4.7B )。 据统计， 6.6xl 〇 ⁵ 个脐带血原代 M SC 在体
外 扩 增 10 代后可获得 9.9xl 〇 ⁸ 个细胞，扩 增 约 i.5xl 〇³ 倍 。

4.注意事项

(1) 当前用于实验和临床的种子细胞主要为来源于骨髓的 MSC，但其数量随着年龄的增长而明显下降。脐血源性 M SC 的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论 ；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。

⑵ 与 骨 髓 M SC 相比，目前脐血来源的 MSC 仍存在数量少、频度低等问题。据统计 约 有 1/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现 MSC， 3/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞。因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好的对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一 的 MSC 仍是今后需努力探索的方向。

脂 肪 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

近年来研究发现，脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞 群 ，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞(Patricia et al.2001)。

1.材料与试剂

手术器械 (大剪 1 把 、止 血 榭 2 把 、镊 子 2 把 、眼科镊子 1 把 、眼 科 剪 1 把)，筛网 (80目、 2 0 0 目、 4 0 0 目)，平 皿 2 个 ， 50m l 离 心 管 2 个 ， IOml 离 心 管 2 个 。DMEM-LG，PBS，双 抗 ，10% FBS,2% BSA，0.1% 胶原酶，红细胞裂解液 (0.154 mol/LNH4OU 10 mmol/L • KHCO3、 O.lmmol/LEDTA)。

2.方法

⑴将切取的人的脂肪组织放入平皿中，游离血管，用 P B S 冲洗，剪 碎 ，加 入 4 倍体积胶原酶、 1 倍 体 积 B S A 和双抗。

(2) 置 入 50m l 离心管， 37°C 消 化 45 min，并不时摇动。

(3) 将消化成糊状组织的脂肪组织先用 8 0 目筛网过滤，后 用 2 0 0 目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化，重复上述操作。

(4) 过 滤 液 8 〇〇 g 离 心 IOmin，去除上清，加入少许含血清培养液，用吸管轻轻吹打，使之成悬液。

(5) 加 入 红 细 胞 裂 解 液 ，室 温 放 置IOmin

(6) 1200r/min 离心 5m i n ， PBS 洗漆2 遍 。

(7) 用 D M E M = L G 培养液 (含 10% F B S ，100U /m l 青霉素， lOOpg/m l 链霉素湩悬细胞 ，接种于培养瓶中，置 于 37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度孵箱中培养。

(8) 24 h 后更换培养液。

3.结果
体外培养的脂肪来源的 M S C 易扩增，并呈现成纤维细胞样形态，这与骨髓来源的 MSC—致 (图 4.8)。

4.2.1.4 M A P C 的 分 离 培 养 2 0 0 2 年 ， J i a n g 等从骨髓中分离纯化了一种更为原始的干细胞，称为多能成体祖细(multipotent adult progenitor cell, M APC)(Yuehua et al. 200 2 ，Yukari et al. 2003)。 研究表 明 ， M A P C 具有胚胎干细胞的某些特征，不仅可在体内、外分化成包括 3 个胚层来源的几乎所有组织的细胞，而且具有极强的增殖能力, 体外培养扩增后至少可传 3 0 代以上。
其表面标志为： CD13⁺ 、 CD44^- 、 CD45
^- 、 c - k i t ^- F lk -1 ^dim 和 M H C -IIclass ^- 。

1.材料与试剂

⑴ M A C S 磁珠分选系统。

⑵ 扩 增 培 养 基 组 成 ： 60%DMEM-LG; 40%MCDB-201; Ix 胰岛素-转铁蛋白-砸；Ix 油酸-牛血清白蛋白； 10^-8 m0I/L 地塞米松； 10^-4 moI/L 抗 坏 血 酸 2-磷酸 盐 ； lOng/mlPDGF-BB; I0ng/mlEGF; 2% 胎牛血清。

2.方法

(1) 取健康人骨髓，用 l. 〇77 g/ml 的 Ficoll-Hypaqiie 分离液分离获得单个核细胞。

⑵ 以 Ix lO ⁵ 个/cm 2 的密度接种于纤维结合素包被的培养皿底部，加入上述扩增培养基。

(3) 24 h 后 ，去除未贴壁细胞。

⑷ 细 胞 长 到 8 0 % 融合后，以 5x IO³ 个/c m 2 的密度进行扩增培养。

(5) 继续培养 2〜 3 周。

(6) 收获细胞，利 用 M A C S 磁珠分选去 除 CD45⁺ /GlyA⁺ 阳性细胞。

(7) 然后将洗脱的细胞以 1 0 个/孔的密度接种于纤维结合素包被的 9 6 孔板中培 养 ，细胞密度维持在 (0.5〜 1.5)x l 0³ 个/
c m 2。

3.结果检测

人骨髓来源的 M A P C 形态呈多角形 (图 4.9)，细胞胞质少，胞核周围有颗粒其倍增时间为 48——60 h 。

4.注意事项

(1) M A P C 培养与培养条件、细胞密度、 C O 2 浓度、培养 基 p H 、胎牛血清及培养皿的类型等均有关。

(2) 由于高密度下 M A P C 易分化，因此不同种属来源的 M A P C 的细胞种植密度不同 ：小 鼠 和 大 鼠 M A P C 最 适 密 度 为 500——1000 个 /c m ² , 人 M A P C 最 适 密 度 为 1500〜 3000个/c m ²。