细胞实验最佳抗生素浓度确认

在哺乳动物细胞中产生稳定的细胞系时，如果表达系统携带耐药基因，则通过在培养基中添加抗生素药物来选择稳定转染/转导的细胞是一种有效的方法。由于哺乳动物细胞对抗生素的敏感性因细胞类型而异，因此必须通过单独的杀伤曲线实验来确定杀死非转染或非转导细胞所需的抗生素的最低浓度

稳定细胞株已广泛应用于重组蛋白、抗体生产、检测分析、免疫治疗药物开发等研究领域。表达的蛋白/抗体稳定性更好，批次间差异小，是生物医药研发的基础。

【材料试剂】胎牛血清、DMEM、胰酶、抗生素

【仪器用品】CO₂ 培养箱、生物安全柜

常见真核抗生素工作浓度：

以 puromycin 为例：

1. 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；
2. 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；
3. 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 含完全培养基的 6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于 37℃、5% CO₂  培养箱；
4. 24 h 后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达 80% 左右传代培养，胰酶消化传代；

以 48孔 板铺细胞，根据每孔推荐的细胞量加入对应体积的上述细胞悬液，以培养基补足体积至 500μl，细胞密度在 50%-80% 之间；

1. 铺板第二天，先将 puromycin 用培养基稀释至 0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、 6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml，然后加入到准备好的、含有细胞的 48 孔板中；
2. 加 puromycin 两天后观察细胞状态（未加药组密度在 60%～90% 之间），最低导致细胞死亡殆尽的浓度，即为该细胞 puromycin 筛选的最佳浓度。

1. 若上述过程未筛选到有效杀伤浓度，或者设计的最低浓度也将细胞全部杀伤，需重新设计药物梯度筛选；
2. 一些细胞对特定的抗生素敏感性高，若出现某种抗生素即便低剂量也致死的情况，需要更换载体抗性基因及抗生素种类。