🔥 病毒感染细胞

质粒 DNA 为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2 为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜，pMD2.G 为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine 2000 进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因 RNA 与 psPAX2、pMD2.G 基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。

在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质 RNA 反转录出 DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒 DNA 只能转录出病毒 RNA 和表达目的基因，却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的，并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。

脂质体转染试剂、293T 细胞、质粒 DNA

DMEM、病毒液、荧光显微镜、6 孔板

离心管

质粒 DNA 和其他包装质粒共转染 293T 细胞产生病毒（即病毒包装）共转染的操作步骤：

第一天：

用无抗生素 DMEM + 10% FBS 铺板 293T 细胞，2 ml/孔，确保第二天细胞密度达到 80%~90% 融合度。

第二天：

（1）500 μl 无血清培养基稀释 2 μg 表达质粒 + 1.5 μg psPAX2 + 1.5 μg pMD2.G。

（2）500 μl 无血清培养基稀释 15 μl 脂质体转染试剂。

（3）5 min 后，将 DNA 溶液和脂质体溶液混合，室温静置 20 min。

（4）从 6 孔板中吸出 1 ml 无血清培养基，然后滴加入 1 ml 质粒和脂质体混合物。

（5）6~10 h 后，移除含有 DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液 DMED + 10% FBS（从此刻开始算时间）。

第三天：

转染 24 h 后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到 70% 以上。

第四天：

（1）转染后 48 和 72 h 分别收获含病毒的上清。

（2）3000 rpm 离心 20 min，0.45 μm 滤膜过滤，去除细胞沉淀。

（3）12000 rpm 离心浓缩病毒，分装，-80 ℃ 贮存。

（4）滴度测定。

（5）慢病毒感染细胞：将对数生长期的细胞消化重悬后，按 1×10⁵/L 的密度接种于 12 孔板，生长过夜后，将 70~80% 的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入 PBS 浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。

24 h 左右可换液，48 h 即可看荧光，具体根据细胞状态来看。若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。

1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。

2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养 10 h 左右可根据培养基颜色加培养基。

3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。

4.在加病毒后一般 24 h 左右可换液，48 h 即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。