原理
慢病毒 （Lentivirus） 是以 HIV-1 为基础，使用疱疹病毒 VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体，其毒性基因已被剔除并以外源性目的基因取代，属于假型化病毒。区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。重组慢病毒载体慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
用途
重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建。
材料与仪器
【材料试剂】胎牛血清、胰酶、Puromycin、D-Hanks
【仪器用品】荧光显微镜、CO2 培养箱、倒置显微镜、离心机、生物安全柜
步骤
1．准备目的细胞
（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37 ℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 完全培养基的 6 cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于 37 ℃、5% CO2 培养箱。
（4） 24 h 后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达 80% 左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染
（1） 贴壁细胞：
a. 处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 3~5×104 个/mL 细胞悬液，并根据表 1 接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到 15%~30% 左右。
表 1. 贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积
b. 按照预实验结果，参考表 1 更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。
c. 参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养，一般为感染后 8~12h 左右。
（2） 悬浮细胞：
a. 按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 3~5×104 个/mL 悬液，并根据表 2 接种相应的细胞数到培养板中，使铺板量达到 15%~30% 左右。
表 2. 悬浮细胞接种体积
b. 铺板后无需培养，参照预实验确定的感染复数（multiplicityofinfection，MOI）加入最适病毒量感染。
c. 参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为 8~12h 左右，将各孔中细胞收集到干净的 1.5 ml EP 管中，以 2000 rpm 离心 2 min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养。
3． 观察感染后细胞状态及感染效率
（1） 细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证空白对照（NC）组和对照（CON）组细胞状态相当。
（2） 一般而言，下游为细胞功能实验，保证感染效率达到 80% 左右；若为筛靶实验，则感染效率需达到 90% 以上。
a. 荧光标记的慢病毒感染。感染后 72 h 左右，荧光显微镜观察报告基因（如 GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率；
b. 抗性基因标记的慢病毒感染。一般于感染 24~48h 后，换用含抗生素（如 puromycin）的培养基筛选细胞，细胞存活率即为阳性感染率。
4． 细胞状态良好，感染效率合格组，可用于下游检测；否则应重新感染。
注：操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都需要用消毒液处理后才能丢弃。
注意事项
（1）如果短时间（3 天）内进行实验，可以将病毒液暂放置 4 ℃ 保存；如不能在短期内全部使用，需将慢病毒液分装后置于 -80 ℃ 冰箱保存（根据每次的使用量进行分装，将定量的病毒液置于冻存管中，做好日期和储存量标记，封口膜密封）。病毒液可存放于 -80 ℃ 冰箱约 6 个月，如储存时间超过 6 个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。
（2）慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同，在使用慢病毒前可以查阅相关文献，了解慢病毒对目的细胞系的 MOI 值。
常见问题
（1）病毒感染效率低?
答：慢病毒对细胞的感染效率受多重因素影响，如细胞自身生长的状态、细胞数量，细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖，轮廓清晰，合适的细胞密度（一般为 20%~30%），选择最优的感染条件可以更好地保证感染效率。对于悬浮细胞，可以采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如将细胞培养板密封后，用平板转子离心机 1000 g 离心 1 H，再放回培养箱中正常培养。
（2）加入慢病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？
答：这种情况是由于慢病毒对该细胞有一定的毒性作用，需要调整并降低感染的 MOI 值，并且在感染后 4 小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。若只有目的病毒组的细胞死亡厉害，需要考虑构建入载体的基因是否存在功能。
（3） 质粒转染 293 T 的荧光很强而慢病毒感染 293 T 很弱？
答：这是大多数客户都会常问的问题，转染和感染都是在 293 T 中进行的，差异主要原因在于以下几点：
首先，性质差异：转染是带有目的基因的质粒 DNA 在转染试剂作用下强行进入细胞的过程，而感染是慢病毒颗粒和目的细胞相互作用，通过受体结合、细胞吞噬等过程，慢病毒基因组进入到细胞中；
其次，表达环节不同：转染的 DNA 进入细胞后，转录为 mRNA，之后就可以翻译了；而慢病毒是 RNA 逆转录病毒，感染细胞后，先逆转录为 DNA，再转录为 mRNA，然后才是翻译，多了几个步骤；
最后，拷贝数不同：转染 293 T 的基因拷贝数可以达到 1000 以上，而慢病毒感染 293 T 的基因拷贝数大概在 10 左右，相差了有 100 倍左右。
来源：丁香实验
