G418筛选慢病毒感染稳定细胞株

用慢病毒筛选稳定细胞株，以G418筛选方法为例，筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系。

A 、 G418 抗生素最优浓度筛选

每种细胞对抗生素的敏感性不同，因此，准备建立稳定细胞系之前，需要确定能够在10-14天杀死细胞的最佳浓度。

方法如下 ：

1、将细胞稀释到1000个细胞/mL，接种到24孔板，每孔1ml。

2、接种后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选。3、每隔3天跟换1次培养液，保持G418浓度不变。

4、选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。

B. 慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选

1 、 在6孔板培养皿内种植约5×10^4细胞CO2 孵箱培养24小时。

2 、 准备 3ml 培养基，加入Polybrene，终浓度为6-8 μg/ ml。将制备好的适量病毒颗粒加至上述培养基，轻吹混匀。去除旧的培养基，加入含病毒培养基。

3 、 病毒感染后 24小时，用新鲜的完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养48小时。

4 、 换用含最优浓度G418 的培养基。根据细胞敏感性不同，以后每隔3-5天换用新鲜的含有G418的培养基，以替换含大量死细胞的培养基。待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm 培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm 平皿内，待细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA 水平鉴定基因过表达或敲低效率。

Polybrene 配制：用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（浓度为10 mg/ml），高压灭菌，可以在4 ℃稳定存放1 年，也可冻存于-20℃。干粉可以在4 ℃ 稳定存放数年。

G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。