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    基本方案 有选择标记的产病毒稳定细胞株的制备

    最新修订时间：

    材料与仪器

    二个反转录病毒包装细胞株 反转录病毒载体包含选择性标记
    PBS 细胞染色液 组织培养皿
    完全的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器 克隆形成环

    步骤

    1•第1 天 ，接 种 5X IO5 个细胞/6cm皿 的 P E 501反转录病毒包装细胞于完全D M E M / 10% FBS 中，孵育 Id。 需 要 二 个 不 同 的 包 装 细 胞 株 ；第 一 个 细 胞 株 产 生 的 病 毒 一 定 能 够 传 染 第 二 个 细 胞 株 ，也 就 是 ，他 们 一 定 是 不 同 的 但 可 兼 容 的 假 包 膜 （ 表 12. 4.3)。 2•第2 天 ，换 4m l 新鲜的组织培养基。用包含选择标记的反转录病毒载体质粒进行磷 酸钙转染（ 支持方案1 ) 。孵 育 Id。 3. 第 3 天 ， P 及弃转染的P E 5 0 1 细胞的培养基再力口 4m l 新鲜的完全D M E M /10% F B S 。 对于每个转染的P E 501细胞皿，接 种 5 X IO5 个 细 胞 /6cm皿 的 P A 317细胞于完全 D M E M /10% FBS 中，孵育 Id。 第 4 天，给 P A 317细胞换培养基，培养基含4jug/m l 的 Polybrene (储备溶液稀释1000

    倍 ) 。 5. 使用IOml注射器，把 3m l 包含病毒的培养基从转染的PE501细胞的每个皿移出， 而且用〇.45Mm 的低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器过滤培养基除去活细 胞。留 Iml培养基在皿里使细胞不干死。 6. 用 Iml过滤的来自一个转染的PE501细胞皿的包含病毒的培养基传染一个皿的 P A 317细胞，另一个皿用IOjlJ 来自相同的PE501皿的培养基。孵 育 5dD 7. 胰蛋白酶消化转染的PE501细胞并以每个皿1 : 2 0 的稀释度接种至6c m 皿里，培 养基包含针对选择标记的适当药物，比 如 〇.75m g /m l G 418， 4m m o l 组氨醇，或 0. 4m g /ml潮霉素B 。孵 育 5d。 8. 用 I.5m l 细胞染色液染色5min。用水洗去染色剂。计算集落形成率以估计D N A 的 转染效率（ 典型的转染效率是1000个集落/y g 质粒D N A ) 9. 转染P A 3I7 细胞后Id (第 5 天） ，胰蛋白酶消化传染的P A 317细胞并以每个皿 9 : 1 0 和 I : 1 0 的稀释度接种至I0c m 皿里，用 IOml包含适当药物的培养基（ 第 7 步） 孵 育 5〜10d。 10. 药物抗性集落形成后，使用克隆环从皿里分离包含小量集落的克隆（ 约 10个集落） (单元3.1)。用包含筛选药物的培养基扩大培养以提供充足的细胞冻存和分析。 11. 当克隆细胞株被充分扩大培养后，每个克隆冻存一或两个玻璃小瓶备用以防止培养 物筛选期间偶然遗失，即便是最好的病毒载体生产者。 12. 逋过选择标记的转移测定病毒载体的滴度（ 支持方案2)。 13. 鉴定那些抗药性克隆，目的细胞能在选择性培养基中生长，分析插入的c D N A 的表 达 。 M . 抽 提 克 隆 的 染 色 体 D N A C 如 附 录 3A ) 。选 择 一 种 限 制 性 内 切 核 酸 酶 来 消 化 D N A ， 这种限制酶只在病毒的L T R 区存在唯一的酶切位点，而在周围的染色体中 任 音 切割。 1 5 . 用 c D N A 探 针 Southern blot杂 交 分 析 被 消 化 的 D N A ( 附 录 3G )。 16. 用 一 个 原 病 毒 载 体 检 测 辅 助 病 毒 （ 支 持 方 案 幻 的 产 生 并 丢 弃 产 生 辅 助 病 毒 的 任 何 克 隆 。 17. —旦一个克f奎细胞株被鉴定具有所需的特性，融解备用玻璃小瓶细胞之一（ 第 n 步） ，扩 培 养 ，并冻结更多的细胞以备将来使用。 大 夕 数 的 克 隆 能 持 续 产 生 病 毒 2 个 月 以 上 ，而 且 如 果 病 毒 滴 度 下 降 ，融 解 一 个 新 的 玻 璃 小 瓶 来 使 用
    备选方案1 没有选择标记产病毒稳定细胞株的制备 这个步骤中用pSV2neo作为选择标记质粒，但是其他有选择标记的质粒同样能很 好地表达。 P A 3I7 包装细胞被用于这一个例子，但是其他的包装细胞株能被替换。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 反转录病毒包装细胞（ 如 P A 317,见 表 12. 4. 1) V 含 4. 5g/L 葡萄糖和 10% 的 FBS (V /V ) 的D M E M (D M E M /10% FBS) 反转录病毒包装细胞（ 如 P A 317,见 表 12. 4. 1) 反转录病毒载体质粒D N A 有选择标记的质粒D N A : 如 pSV2neo 0. 75mg/ml G 418 (活性药物）或其他针对选择标记质粒的选择药物• 6c m 的细胞培养皿 克 隆 环 （ 单元3. 1)，无菌 1. 第 1 天，接种5X 105 个反转录病毒包装细胞P A 317于含4ml D M E M /10% F B S 的 6c m 细胞培养皿中。孵育Id。 2. 第 2 天，换 4m l 新鲜的培养基。用磷酸钙转染法（ 支持方案D ，共转染1()Mg 反转 录病毒载体质粒D N A 和 0 •Ijug或 〇.2哗 pSV2neo质粒D N A 。孵育Id。 3. 第 3 天，吸弃转染P A 317的培养基并加4m l新鲜的培养基。孵 育 ld。 4.第 4 天，胰蛋白酶消化转染细胞，再以1 :2〜I : 10的稀释度接种到包含750|ug/ml G 418的培养基的IOcm皿中。孵 育 5〜K M 。 5. 使用克隆环（ 单元3.1)，分离包含小量集落的药物抗性克隆，扩大培养。 6•当克隆细胞株充分扩大培养后，每个克隆冻存一或两个玻璃小瓶备用以防止培养物 筛选期间偶然遗失，即便是最好的病毒载体生产者。 7. 如果可能，检测细胞株的病毒载体c D N A 编码的蛋白质的产生。 8. 抽提克隆的染色体D N A (附录3A ) 。用限制性内切核酸酶消化和Southern blot杂交 分析D N A (附录3G ) 。 9. 确定病毒载体效价。 10. 用标记补偿法检测辅助病毒（ 支持方案3),扩大培养并收获病毒载体。 （ 基本方案第 16〜18步） 。 备选方案2 短暂转染的病毒载体的制备 材料 反转录病毒包装细胞（ 表 12. 4.1)和适当的细胞培养基 反转录病毒质粒D N A 6c m 的细胞培养皿 IOm卜注射器 0. 45p n 的低蛋白质结合的纤维素乙酸盐注射器式滤器
    沉淀缓冲液中并持续搅拌。室温孵育30min。可以观察到淡淡的云雾状混浊，如果重 组物保持清亮或者有大的团块样混池，用 新 鲜 的 新 准 备 一 份 新 的 沉 淀 溶液。 7.检查管中的沉淀物是均勻的而不是成块的沉淀。把沉淀物加入一个含反转录病毒包 装 胞 的 6cm 皿并摇晃皿使其分布均匀。孵育并着手进行选择或者筛选细胞（ 基本 方案或备选方案2 ) 。 支持方案2 确定带选择标记的病毒载体的滴度 为不携带标记基因的病毒载体确定滴度更困难：确定这样的病毒载体的滴度可以做 被转染细胞的Southern blot杂 交 （ 附 录 3G)，用被分析的病毒载体或者携带允许滴度 直接被确定的选择标记的另一个可匹配的病毒载体。 材 料 （ 标V 的条目参见附录D 对待检病毒载体的假包膜敏感的细胞（ 如 NIH 3T 3 或 H e L a 细胞）和合适的细胞 培养基 4mg/ml 聚 凝 胺 （ Sigma) 待检的反转录病毒载体原种（ 如基本方案或备选方案1 或 2) 选择的药物： 0.7511^/1111〇418,0.4111111〇1潮霉素： 6，或 4111111〇1组氨醇〇 V 细胞染色溶液 6c m 的细胞培养皿 1. 第 1 天，接种5XIO5个对病毒载体假包膜敏感的靶细胞在含适当细胞培养基的6cm 细胞培养皿中。孵育Id。 2. 第 2 天，换含4yg/m l 聚凝胺的培养基培养细胞，并加人不同数量的反转录病毒储存 液 （ 0.01〜1004) 在不同的皿里。孵育Id。 3. 第 3 天，胰蛋白酶消化并以1 :20的稀释度接种到包含适当浓度的药物的培养基里。 孵 育 5〜8d。 4. 集落形成之后，用 1.5m l 细胞染色溶液染色5min。用 H 2O 洗去染色剂和计数集落。 计算病毒滴度。 病 毒 滴 度 用 每 毫 升 形 成 集 落 数 表 示 （ C F U /m I) ，是 用 集 落 的 数 目 除 以 原 体 积 (ml) 即 用 来 转 染 的 是 未 稀 释 病 毒 原 种 ，所 以 要 乘 以 2〇 以 纠 正 1 : 2 0 细 胞 稀 释 度 。 支持方案3 辅助病毒的标记补偿检测 虽然这个检测略微沉闷而且较慢，但它很可靠并非常敏感。 材料 L A P S N 病毒载体（ 图 12. 4. 2) 对 L A P S N 假包膜敏感的反转录病毒包装细胞（ 表 12.4.D 和合适的细胞培养基 对病毒载体假包膜敏感的天然靶细胞：如 NiH 3T 3 或 HeLa细胞
    待 检 的 反 转 录 病 毒 载 体 原 种 （ 基 本 方 案 或 者 备 选 方 案 丄 或 质 结 合 的 纤 维 素 醋 酸 盐 注 射 式 滤 器 过 滤 含 4mg/ml 聚 凝 胺 （ sigma) PBS (附录 I PBS 项 ） 阳 性 对 照 病 毒 ：双 向 性 有 复 制 能 力 的 辅 助 病 毒 一 6c m 的 细 胞 培 养 皿 2 ) ，用 0. 45jum的低蛋白 IOml注射器 0. 45p n 的低蛋白质结合的纤维素醋酸盐注射器式滤器 1.制备含LAPSN 病 毒 载 体 （ 图 12.4.2)的病毒原种，可以来自短暂转染的反转录病 母包装细胞（ 备选方案2 ) 或者来自稳定的产生病毒载体的细胞株（ 基本方案或备 选 方案1)’LA PSN 病每载体可以编码喊性憐酸酶（ aikaiine phosphatase， AP)。 2•用病毒转染天然的靶细胞。传代细胞2 个星期允许辅助病毒（ 不应该存在）繁殖。 3. 通过传染不包含病毒载体的亲代细胞为病毒载体制备化验细胞。 分装那 些 不 释 放 反 转 录 病 毒 载 体 的 细 胞 （ 非 产 病 毒 细 胞 ） ，它们应该储存在液 氮 中 以 备 将 来 的 标 记 补 偿 使 用 。非 产 病 毒 细 胞 需 要 一 次 产 生 。 4. 第 1 天，接 种 5XlO5 个包含LA PSN 的非产病毒细胞在含适当培养基的6 c m 细胞培 养皿中。孵 育 Id。 5. 第 2 天，通过加Im l过滤的待检反转录病毒原种， 3mi 细胞培养基和知g/mi 聚凝 胺 ，传染非产病毒细胞。用少量的有双向复制能力的辅助病毒传染一些皿作为阳性 对照。 6.从 第 3 天起，孵育细胞2 周允许辅助病毒繁殖。一 周 2 或 3 次，用胰蛋白酶消化细胞 再 以 1 : 10〜1 : 4〇接种。保持细胞相对高地密度。 7.第 1 6 天 ，以 IO5 个细胞每6cm皿接种对病毒载体假包膜敏感的天然靶细胞（ 与非产 病毒细胞株同种的细胞） 。同时，更换长满的非产病毒细胞的培养基。孵 育 Id。 8•第1 7 天，收获来自非产病毒细胞的培养基和用O . ^ pm 低蛋白质结合的注射式过滤 器除去细胞和碎片。 9. 用 Im l含样品的培养基， 3m l细胞培养基和4jLig/m l聚凝胺，传染天然的粑细胞。孵 育 Id。 10. 第 19天，染色受传染的靶细胞做碱性磷酸酶活性分析（ 支持方案4)。 染 色 反 应 阳 性 提 示 来 自 非 产 病 毒 细 胞 的 病 毒 的 感 染 ， 由 于 反 转 录 病 毒 原 种 中 辅 助 病 毒 的 存 在 。 支持方案4 染色法检测培养细胞的碱性磷酸酶活性 这一方案是针对6cm 皿培养细胞的，但是容易对其他尺寸的皿调整条件。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 转染了编码碱性磷酸酶的病毒载体的细胞培养物（ 如 LAPSN) 在 6 c m 的细胞培养 皿中 0 . 2 5 % ( W V ) 戊 二 醛 /PBS V P B S
    V 碱性磷酸酶染色缓冲液 V 碱性磷酸酶染色液 1. 吸弃转染编码碱性磷酸酶的病毒载体的细胞培养物的培养基。室温用3ml 0.25%的 戊二醒固定细胞5〜lOmin。使用不转染细胞做为阴性对照和转染已知的产生碱性磷 酸酶的细胞做为阳性对照。 2. 用 2〜3ml P B S 洗细胞两次。加 2ml PBS 65°C 加 热 30min使细胞的碱性磷酸酶失 活 。 3. 皿冷却后，吸弃P B S 并用2m l 碱性磷酸酶染色缓冲液洗一次，除去磷酸盐。 4.加 1.5m l 碱性磷酸酶染色液。室温孵育4h (依赖细胞类型和背景碱性磷酸酶活性）。 5. 计算碱性磷酸酶阳性细胞。

    来源：丁香实验

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