慢病毒生产方案

一、材料和试剂

1. Hairpin-pLKO.1vector（OpenBiosystems）

2. Packagingvectors:第二代包装质粒包含gag,pol,和rev基因（pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2）和包被质粒（pMD2.G）（Addgene）

3. 脂质体2000（Invitrogen）

4.OptiMEM无血清培养基（Invitrogen）

5. 293T包装细胞（ATCC）

6. DMEM（Invitrogen）

7. 胎牛血清（Invitrogen）

8. 青/链霉素（Invitrogen）

9. 6 cm 细胞培养皿（Fisher）

10. 45 um 过滤器（Fisher）

二、仪器

1. 细胞培养箱

2. 离心机

三、实验步骤

1. 6 cm 细胞培养皿中种植293T细胞，细胞密度为1.3~1.5×105，每孔体积6 ml。

2. 孵育细胞24 h（37℃，5%CO2），或者孵育至第二天下午。约24 h 后，细胞融合度应该达到了70%。

3. 转染包装细胞:

（1）准备含有3种转染质粒的混合物

900 ng 包装质粒

100 ng 包被质粒

1 ug pLKO.1质粒

（2）用OptiMEM稀释脂质体2000：10 ul 脂质体+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂质体试剂，通过颠倒旋转或者轻弹管子来混匀，（不能用移液器或者涡旋来混匀），室温下孵育5分钟。

（3）向稀释的脂质体中逐滴滴加上述3种质粒混合物，颠倒旋转或者轻弹管子混匀。

（4）室温下孵育转染混合物20~30分钟。

（5）小心将转染混合物移入包装细胞的培养液中。包装细胞对外源干扰非常敏感-小心不要让细胞从板上脱落。每板需要转染混合物的总体积为100~125 μL。

4. 孵育细胞18 h（37℃，5%CO2），或者直到第二天早上。

5. 更换培养液以去除转染试剂，为了进行病毒收获更替为6 mL 的收获培养液。

6. 孵育细胞24 h（37℃，5%CO2）。

7. 在转染约40 h 后收集含有慢病毒的培养液。将培养液移入储存管中。替换为6 mL 的收获培养液。

8. 每12~24 h 重复上述病毒收获过程，并且替换为6 mL 的收获培养液。病毒滴度在收获过程中会逐渐的减弱；通常总共收集2~3个时间点的病毒。最后一次收获之后,丢弃包装细胞。病毒收获物可以按需要进行合并。

9. 1250 rpm 的转速旋转包含病毒的培养液5分钟，使得在收获过程中所收集的包装细胞变成球状。将上清液通过45 um 过滤器，然后移入无菌储存管中。

10. 病毒在4℃可以保存时间较短（数小时到数天），但是在-20℃或在-80℃可以冻存较长时间。为了减少冻结/解冻的次数，在长期储存之前，需将大量的病毒产品分装入小的储存管中。