材料与仪器
步骤
用生长在CFlO或者是CF2 设备中的细胞生产载体
材料
试剂
转染细胞系： 293T
早 期 的 293T 细胞比较好。它们可以在种植转染前持续均一地分裂。
DMEM加 1 0 % 胎 牛 血 清 （DMEM-10)、 lOO^/ml 青霉素 、 lOOug/ml 链霉素以及2mmol/L L-谷氨酸
质粒 DNA: pMD.G、 pFP93、 pGINSIN
对于体外转染，质 粒 DNA应该是无菌的且不含内毒素。商业试剂盒如去除内毒素的质粒大 提 试 剂 盒 （ QIAGEN 2362)是可以信赖的。氯化铯纯化的方法也可以。
转染试剂
Tris-HCl (10mmol/L ， pH 8.0)用于稀释质粒 DNA
CaCl2 (2. 5mol/L)
高压灭菌然后保存在一20°C
2X HEPES缓冲 盐 水 （HBS)
保存液—Na2HPO4 ： 52. 5g Na2HPO4, 5000ml H2O0 2 X H B S： 8〇 g NaCK 65g HEPES (钠盐） 、 IOOml Na2HPO4保 存 液 。小 心 优 化 p H 是 非 常 重 要 的 。用 l m〇 l/L 的NaOH调 节 p H 到一系列的设定好的范围很窄的点，如 pH6. 95、 7 、 7. 0 5 等 。调节终体积到 5000ml。最 佳 的 PH6. 9 5 可供选择。但是最终使用储存液完全由转染效率的经验来决定 。冻 存 （一20°C )。 p H 随着时间变化，因此可以得到不同转染百分比。每 隔 3〜6 个月需要重新配制。通过转染表达G FP的质粒可以发现最佳的转染试剂可以转染9 5 % 的 293T
细胞。可以将转染试剂冷藏或者冻存，但重要的是在转染的时候使用转染试剂时应该在室温的条件下进行。
胰酶-EDTA (细胞培养级别）
设备
吸 气 瓶 （2L Kimax) (Kimble Glass 14607-2000)或者是类似的吸气设备
烧 杯 （1L ，与所用的培养基体积一样大小）
培 养 瓶 （无菌塑料瓶； CF2: 250ml， CFlO: IOOOmD
用硅管和连接器连接培养瓶（无菌）的细胞工厂
漏 斗 （无菌）
培养箱，预设到37°C、 5% CO2 (架子应该精确调整到适合细胞工厂）
显微镜
CF2 工厂培养的细胞可以用绝大部分组织培养显微镜观察。对 于 CFlO细胞工厂来说，需要 用 Nikon Eclipse TE300或者类似的显微镜观察。
Nunc细 胞 工 厂 （1 层 CF1、 2 层 CF2、 10层 CFlO或者40层 CF40)
Nimc细 胞 工 厂 启 动 试 剂 盒 （170769)带 有 H D PE连 接 器 （171838)、封盖(171897)、蓝色密封盖（167652)和 Gelman 4210细菌空气通风过滤膜。能透过空气盖子的组织培养瓶（175cm2; T 175)
方法
1.准备细胞和转染
对 于 C F lO 设备
a. 转染前3 天，接 种 6 瓶 T 175,每瓶含有6X 106个 2Q 3T 细胞，培养48h。
b. 转染前一天，用胰酶消化T 175细胞，接 种 2. 5XIO8个 293T 细胞到CFlO中。
对 于 C F2 设备
a•转染前三天，接种 2〜3 瓶 T 175,每瓶含有以107个293丁细胞，培 养 4811。
b•转染前一天，用胰酶消化T 175细胞，接 种 5X 107个 293T 细胞到CF2 中
2•以 1 : 3 : 3 的比例加人 3 种 质 粒 （pMD.G 、 pFP93、 pGINSIN)。
对于 C F 1 0 : 混 合 84. 5/253. 5/253. 5ug 质粒到一个250ml的无菌瓶中。用 1〇mm〇1/LTris-HCl ( p H 8. 0 ) 调节到 60. 5ml 的体积，加入 6. 5ml 2. 5 m m o l / L CaCl2，然后在密闭的瓶中旋转混匀。
对 于 C F 2 : 混 合 16. 9/50. 7/50. 7哗 质 粒 到 一 个 2 5 0 m l 的无菌瓶中。用 1〇 mm〇 i/LTris-HCl ( p H 8. 0 ) 调节到 60. 5ml 的体积，加入 6. 5ml 2. 5mol/L CaCl2，然后在密闭的瓶中旋转混勻。
3•倾斜设备把瓶里面的液体倒掉，然 后 加 入 67ml (CFlO) 或 者 是 13. 4ml (CF2)2X HBS0
4.立即轻轻倒转瓶子4〜6 次 混 匀 （最好是旋转） 。沉淀DNA 3〜5min。
5.把 DNA-Ca2PO4混合物转移到另一个容器中，停止沉淀。
对于CFlO:转 移 到 800m l的新鲜培养基中，放到—‘个IOOOml的无菌塑料有盖的瓶中。这个瓶子可以和一个过滤单元一起使用。
对 于 CF2 : 转移到185m l的新鲜培养基中，放到一’个250m l的无菌塑料有盖的瓶中。
6•如下更换培养基：
a. 把细胞工厂的培养基倒人到一个脏的烧杯中，弃掉。
b. 将无菌的硅管相连漏斗，然后接到细胞工厂。
c. 将细胞工厂放到一边使得打开的通风口对于工作外层关闭。
d. 提高漏斗，缓慢地将转染混合物和新鲜培养基倒人到漏斗中。确保能均勻分散
到每个隔间。
e. 举起连接/通风管末端的细胞工厂，使得培养基流过打开的通风管口，从而阻止
上层隔间的培养基漏到下层。
f. 把细胞工厂准确地水平摆放到培养箱架子上（细胞可以刚好被转染混合物覆
盖)。
7•培养细胞16〜18h，用显微镜观察组织培养的外层。一个较好的D N A _羟磷灰石沉淀
(比细胞小很多的黑色斑点）应该呈现在细胞的表面。
8•如下更换培养基：
a•把细胞工厂的培养基倒人到一个脏的烧杯中，弃掉。
b. 将无菌的硅管相连漏斗然后接到细胞工厂，然后把细胞工厂放到一边。
c. 提高漏斗，缓慢地将1000ml (CFlO) 或者是200ml (CF2 ) 新鲜培养基倒人到
漏斗中。确保能均匀分散到每个隔间。
d. 举起连接/通风管末端的细胞工厂，使得培养基如步骤6 一样流过打开的通风
管口。
e. 把细胞工厂准确地水平摆放到培养箱架子上。
用 生 长 在 CFlO或 者 是 C F 2 设 备 中 的 细 胞 收 获 和 浓 缩 载 体
这个方案描述了用生长在CFlO或者是CF2 设备中的细胞收莸和浓缩载体的方法。
材料
试刻
漂 白 水 （10%)
乙 醇 （7 0 % 溶于组织培养级别的双蒸水中，分子级）
磷酸盐缓冲液（PBS，组培级）
蔗 糖 （2 0 % ) ， 20mmol/L T ris(pH7. 4)， 100mmol/LNaCl 溶液
用 0. 45um或者0. 2pm滤膜过滤。
设备
高压灭菌锅
培 养 瓶 （250m l带螺旋盖的塑料瓶）（如 Corning聚苯乙烯培养瓶、 430281)
细 胞 滤 网 （如 BD Falcon、 70um 尼龙、 352350)
带旋盖的冷冻管（1.0〜1.8ml，无菌， Nunc)
过 滤 设 备 （1000ml， 0.22um 孔径大小）（如 Nalgene MF75 系列）
微型离心管（I .5m l和 0. 5ml，无菌）
微型移液器
带刻度的平衡离心管
超速离心机（ Sorvall Discovery 100SE ， Beckman L8-80M ，或者相等设备）
超速离心瓶（250ml) : 异质同晶聚合物超速离心管， Oakridge (Sorvall 54477)带碳 氟 化 合 物 盖 子 （ Sorvall 54421)和 A612转 头 （ Sorvall 119977)或者相等设备。
超 速 离 心 管 （36ml) : 可任意使用的异质同晶聚合物超速离心管（ Sorvall 03141)
用于 SureSpin630 转 头 （ Sorvall 79367) 或者是 SW28 转 头 （ Beckman 342207);
12m l同质异晶聚合物超速离心管（ Sorvall 03699)用 于 TH641转 头 （ Sorvall08224)或者是 SW41Ti 转 头 （ Beckman 341302)。
方法
1.在更换转染细胞培养基之后48h，用一个大的无菌容器收集上清。低速离心几分钟去除细胞残渣。
其他可用的方法，如 用 3〜5min将分离的细胞沉人到瓶底。细胞工厂可以在组织培养架中用高压双蒸水清洗两次然后密封保存到4°C重复使用。
2.把上清倒入到一个50jum的细胞过滤器来澄清上清。然后用〇.22um 的滤器过滤。 一个 IOOOml的 Nalgene设备足够装600〜800m l载体。一 个 500m l的 Nalgene设备在堵塞之前足够装3〇〇 〜 400m l载体。将过滤好的载体上清等均分出一小份（约 2ml)到冷冻管中，用于后面的滴度和复苏对照。储存到一80°C 。
VSV-G假 型 的 FIV 载体在高点的温度下短期可以保持非常稳定， 37°C ， 24h 或 者 是 4°C ，72h 仍有一半的活力。
3•用7 0 % 乙醇清洗要使用的合适转头。
4.如下离心载体上清：
对 于 CFlO
a. 用 7 0 % 乙醇清洗250m l同质异晶聚合物Oakridge超速离心瓶的里面和碳氟化合物盖子。吹干。
A621转头使用可重复利用的超速离心瓶和白色的盖子。这些瓶子不能高压；应 该 用 10%漂白液灭菌。
b. 加 200m l过滤好的载体上清到每个250m l超速离心瓶中。过滤后，载体上清的
总体积将少于1L 。用 PBS调整最后一瓶的体积到200ml。紧紧盖上盖子。
如果这些管子或者是瓶子不满的话，在超速离心的过程中可能会出现部分崩溃的现象。用平衡臂将这些管子连同盖子一起平衡。
c. 在 Sorvall Discovery 100SE 超速离心机（67 000g_ ) 中使用 A612 转头19 000r/min离心，或者是相等设备， 4°C下离心6h。
d•将上清倒掉，把 250m l的瓶子以45°角斜着放在冰上，载体颗粒朝向下。吸去和
载体颗粒方向相反的预冷的液体。然后，将载体颗粒旋转向下，加 6〜7ml PBS
到设定好的第二次的浓度。否则，可以加入适当少量体积的PBS。
e•沿着载体颗粒那一面用吸管加入P B S开始重悬。首先直接清洗管的全长，用液
体直接流向颗粒。这一步对每瓶需要大约5min。将所有的物质加入到一个250m l的瓶子中开始第二次超速离心。
35〜4Oml重悬载体上清到6 个瓶子中。一 些 第 一 次 浓 缩 的 载 体 可 以 等 分 （如 800ul) 到小管并冻存到一8〇°C用于后面的滴度和复苏比较。第一次的浓度复苏时保留5 0 % 〜8 0 % 的转导单位。
f. 对于第二次的浓度，用纳米纯水清洗可反复使用的12m l同质异晶聚合物超速离
心管的里面以去除用于包装的可以和载体颗粒吸附和共纯化的纸纤维。高压灭
菌并冷却到室温备用。管子是不可重复使用的。超速离心将塑料变薄，如果第二次使用，管子将会泄漏。
g•用7 0 % 乙醇清洗SW 41 T i转头的桶和盖子，吹干。加 入 9m l第一次浓缩的重悬的载体和Iml 2 0 % 的蔗糖溶液到12m l同质异晶聚合物超速离心管中。如果有
必要加人PB S填满管子大盘最大体积（10ml)，平衡拧紧。
建议这一步先加5m l重悬载体到超速离心管中，然 后 将 Im l蔗糖溶液直接加入到管的底部，然后再在总体积的上部加入4m l重悬载体。这个技术可以确保在恢复的载体和蔗糖溶液之间形成一个合适的界面。
h•在Sorvall Discovery IOOSE超速离心机中用SW41 T i转头或者相等设备4 C 下24 000r/min (瓶的底部是67 OOOgnnax, 而瓶的顶部是31 OOOgWi) 离也、 I.5h。将可以重新看见颗粒。
i. 用 lOO^J P B S 重悬并清洗管的底部5min。可以先将微量移液器调整到100ul的体积。将枪头保持在液面下以免产生气泡。重悬的液体呈乳白色并带有轻微的黏
性。将重悬的载体加入到一个1.5m l的微型离心管中， 3000g 离 心 3min以去除
没有悬起的物质。
第二次的浓度复苏时和原有的未浓缩的上清相比保留30%〜70%的转导单位。有些复苏可以 达 到 1 0 0 % ，这可以反映出在原始的上清中的聚集的转染单位的分散程度。
j. 将载体颗粒等分到合适的体积（如 50jul或 者 100/^1)冻存到一80°C 。
k. 用 7 0 % 乙醇清洗A621转头去除可能泄漏出来的载体上清。保存到4°C 。
对 于 C F2
a. 用纳米纯水清洗新的36ml —次 性 polyallomer超速离心管的内部，以消除纤维纸板。不会冲走任何与载体颗粒相连的任何碎片。高压灭菌管子，让它们自行
冷却至室温后再使用。
管子是不可重复使用的。超速离心将塑料变薄，如果第二次使用，管子将会泄漏。
b. 每个36m l管子中加人25m l载体上清。缓慢吸取5ml 2 0 % 的蔗糖溶液加入到载体上清的下面。然后加2. 5〜3m l载体上清到最大体积。
c. 在 Sorvall Discovery 100SE 超速离心机（67 OOOgmax) 中使用 SW 28 转头19 000r/min离心，或者是相等设备， 4°C下离心1.5h。这时看不见颗粒。
d•吸去管中的上清并保留一小部分体积。用 P B S或者是其他预设的培养基重悬。
加 lOOul PB S或者培养基到每个管中。用微量移液器清洗管壁。在重悬前用枪
头沿着管的底部清洗。这一步对每个管需要约5min。将所有的上清收集到一个管中。目标是收集1〜2m l重悬的载体。将载体颗 粒 等 分 到 合 适 的 体 积 （如
50ul) —80°C冻存。
第一次的浓度复苏时保留5 0 % 〜8 0 % 的转导单位。
e. 用 7 0 % 的乙醇清洗桶以去除可能泄漏出来的载体上清。把转头和桶保存到4℃
用 生 长 在 T 7 5 细 胞 培 养 瓶 中 的 细 胞 生 产 和 收 集 载 体
材料
试刺
转染细胞系： 293T
早 期 的 293T 细胞比较好。它们可以在种植转染前持续均一地分裂。
DMEM 加 10%胎 牛 血 清 （DMEM-10)、 100U/ml 青霉素、 lOOug/ml 链霉素以及2mmol/L L-谷氨酸
质粒 DNA: pM D .G、 pFP93、 pGINSIN
转染试剂
Tris-H CK (10mmol/L ， pH 8.0)用于稀释质粒 DNA
CaCl2 (2. 5mol/L)
高压灭菌然后保存在一 20°C
2X H EPES缓 冲 盐 水 （HBS)
见方案1 中的成分。
设备
过滤 设 备 （0. 22um， 50ml; Nalgene)
具备可以邊过空气的细胞培养瓶（75cm2, T 75)
管 子 （5m l干净的聚苯乙稀管，如 Falcon 352058)
涡旋混合器用于混合Falcon管子中的转染复合物
方法
1..转染前两天，将细胞培养基调整到可以转染的状态。转染前一天，接 种 3 X 106个细胞到每个细胞培养瓶，生长过夜培养。
2.转染前4h，用 IOml新鲜培养基更换生长培养基。
3•调整 3 种质粒 DNA (pMD.G、 pFP93、 pGINSIN) 的比例为1 : 3 : 3 , 加入 l.O ug pMD.G、 3. Opg pFP93、 3. 0哗 pGINSIN 到一个无菌的 5. Oml 的 Falcon 管中。用10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0 ) 调整体积到 800ul。
4•用一个适中的速度边旋转边加人800ul 2.5mol/L CaCl2，然后让CaCl2沉淀3mol/L将会呈现出一片模糊的乳白色。
5 . 吸取混合物直接加人到一个倾斜的1 7 5 培养瓶的底部的培养基中，如此细胞单层就不会脱落。轻轻晃动使沉淀均匀分散到细胞单层中而不撞动细胞。
6.培 养 16〜18h。然后，更换培养基，用枪吸，轻轻吸取移除培养基，更 换 成 10〜15 m l新鲜培养基。小心不要扰乱细胞单层。
7.继续培养48h。收集上清离心并用0 •22um滤膜过滤。
8.等份分到冻存管中冻存到一80°C 。
来源：丁香实验
