G418筛选的问题

tjmedwnn：关于G418筛选的问题

大家好，请问我用G418筛选转染细胞，首先做最佳浓度确定实验，为什么要取5天杀死大量细胞，14天杀死全部细胞的最小量，我的问题是，为什么取5天，而不是3天或4天2天的，WHY？

做最佳浓度确定实验加药时的细胞数有规定吗，是不是种多种少没什么区别？我感觉书上说的接种数量是不是太少了？细胞数目多对筛选有影响吗？

丁香园网友DXY721认为：

细胞加了G418后不是马上就死，加入后还可以挺一段时间，也就是说还可以传个一两代的样子，差不多就需要三五天的时间。所以在加入G418后的两三天或者三四天内是看不到细胞大量死亡的，五天都够呛。我只转过一种细胞，那种细胞一周到10天的样子才会有死亡的迹象。

做致死浓度筛选的细胞数不要求很多，你最终确定的是药物浓度，跟细胞数多少关系不大。我做的是悬浮细胞转染，我们接种的细胞数是很少的，主要是考虑到悬浮细胞换液困难的问题，我们要尽量保证在致死浓度筛出的14天内尽可能不换液，所以我们种板数一般不能多。

丁香园网友tjmedwnn认为：

我前天接种的细胞数目太少了，没有长起来！

我决定接种的密度大一点，可以这样吗？

丁香园网友DXY721认为：

贴壁细胞做筛选换液比较容易，个人觉得可适当增加接种密度，至少得保证细胞接种后在不加药的情况下存活吧，这样你才能继续加药筛选呀。

丁香园网友wfayew认为：

35mm细胞转染，转染36－48小时后分入2－3个10cm的培养皿中，再过8－12h加入G418开始筛选，这样稀的目的是使抗性细胞长成克隆，到时候消化取单克隆就行了，不像经典的有限稀释法那么慢

一开始确定筛选浓度时的细胞量不用太多，没必要，因为就是观察细胞全部死亡的时间，多了也得死，还浪费资源