腺病毒感染细胞

腺病毒是一种线型双链 DNA 无包膜病毒，它的 DNA 和核心蛋白形成的内核，蛋白外壳是直径约 80 nm 的正二十面体，由 240 个六面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体构成。腺病毒粘附后，五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸与细胞表面的整合素 αvβ 3 和 αvβ 5 结合并相互作用使腺病毒进入细胞。

腺病毒可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

【材料试剂】胎牛血清、DMEM、胰酶、D-Hanks

【仪器用品】荧光显微镜、CO₂ 培养箱、倒置显微镜、离心机、生物安全柜

1．准备目的细胞

（1） 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入 37 ℃ 水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。

（2） 完全解冻后，1300 rpm，离心 3 min，75% 酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。

（3） 吸去冻存液上清，加入 1 mL 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有 3 mL 含完全培养基的 6 cm 培养皿中，轻轻晃匀后置于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱。

（4） 24 h 后更换一次培养液继续培养，待细胞融合度达 80% 左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2． 目的细胞腺病毒感染

（1） 贴壁细胞：

• 处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成 5~10×10⁴ 个/mL 细胞悬液，并根据表 1 接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到 60% 左右。

表 1. 贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积

• 按照预实验结果，参考表 1 更换感染培养基，加入最适病毒量进行感染。
• 参照预实验结果，选择感染后最适时间点更换为常规培养基继续培养，一般为感染后 8~12 h。

（2） 悬浮细胞：

• 按照预实验确定的感染条件，使用感染液将细胞制成 5~10×10⁴ 个/mL 悬液，并根据表 2 接种相应的细胞数到培养板中，使铺板量达到 60% 左右。

表 2. 悬浮细胞接种体积

• 铺板后无需培养，参照预实验确定的 MOI 加入最适病毒量感染。
• 参照预实验结果，选择感染后最适时间点，一般为 8~12 h，将各孔中细胞收集到干净的 1.5 ml EP 管中，以 2000 rpm 离心 2 min，去掉上清液，更换为完全培养基，轻轻混匀后放回培养板中继续培养。

3． 观察感染后细胞状态及感染效率

（1） 细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证 NC 组与 CON 组细胞状态相当。

（2） 腺病毒感染 16~48 h 后观察荧光，保证荧光率达 90% 左右。

4． 细胞状态良好，感染效率合格组，可用于下游检测；否则重新感染。

注：操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都需要用消毒液处理后才能丢弃。

（1）腺病毒长期保存则需放置于 -80℃ 或更低温度的环境中。在 -80℃ 环境中慢病毒可以稳定存放 6~12 个月以上。尽可能避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。

（2）腺病毒有广泛的宿主范围，它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞。

包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染，例如一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性。为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染，需要通过带有标记（如 GFP）的腺病毒对目的细胞进行预实验。

（3）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同，可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染细胞的最佳时期是细胞处于对数生长期时，因此，在细胞消化后 12～24 小时加入病毒。病毒感染时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。一般感染腺病毒 24 小时后就能检测到目的基因的表达，48 小时表达达到较高水平。

（1）如何确定我所用的目的细胞是否可以被腺病毒感染？

答：腺病毒有广泛的宿主范围，它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染，例如一些淋巴细胞系对腺病毒有较强的抵抗性。为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染，需要通过带有标记（如 GFP）的腺病毒对目的细胞进行预实验，预实验的步骤参考「目的细胞感染预实验」。

（2）如何确定感染细胞时腺病毒的最佳浓度？

答：最佳的实验结果需要最佳的腺病毒用量，用量少则达不到 100% 的感染效率，用量多可能会对细胞有毒害作用或其他不可预测的效应。为了确定目的细胞的最适病毒用量，需要在正式实验开始前，建议先完成「目的细胞感染预实验」，以此获得的数据作为正式实验的依据。