细胞实验原创经验

丁香园网友zlawrance的观点为：

（1）细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。建议0.5-1ml之间即可。

（2）许多教科书推荐细胞解冻用37度水，本人发现温度可以适当提高，39度也没有问题，虽然只提高了2度，却可以加速细胞解冻的时间。解冻后有提点挺重要，迅速用75%乙醇消毒冻存管管口和双手，然后进入下一步工作，随时别忘无菌操作。

（3）当无菌操作台经常有多人工作时，记住自己用时，尽量把各种实验用物在紫外灯下消毒30-40分钟， 包括枪头，移液器，废液缸等容易忽略的物品。但是，不要让胰酶和培养液处在紫外灯照时下！

（4）准备用实验台时，关掉紫外灯的同时，应打开鼓风机，如果操作太两边都有风机旋钮，应该保持两边风机风速一致，而且应该大于100，以免飞虫进入（当然不能吹灭酒精灯火苗）。最好再用75酒精蘸洁净一次性纸巾擦试所有可以消毒的地方，尤其是工作面。

（5）如果不是通过两个圆孔进入手臂操作，而需要抬高操作台前置玻璃挡板，一般不要超过15厘米，主要目的还是减少污染几率。

丁香园网友wavypeng的观点为：

(1)做实验时保持白大褂的干净.尤其不是通过两个圆孔进入手臂操作的实验台,白大褂的干净整洁(尤其是袖口处)可直接影响到实验的染菌几率.并最好不要把袖子掳起直接进去操作,因为我们皮肤表面可能会有细菌滋生.

(2)保持实验台的干净整洁,尽量保持实验台上所放物品少一些,并且保持实验台里的东西是专台专用.

(3)初学者常常会将瓶口、瓶盖在火上烧灼的时间少一些来减少染菌的几率，其实这样往往会加大染菌的机会。正确的做法是在火上烧灼片刻后（外焰）立即盖上，并保持一定的通气量，水平放置。

丁香园网友seeworld的观点为：

1、冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。

2、水浴箱是个大问题，我们实验室有次细胞很严重的污染事件，哪里都没出问题，后来查了水浴箱中的水，发现了很多大肠杆菌。所以建议水浴箱一定要及时将脏水倒掉，然后用75％酒精擦洗箱内，最后换上蒸馏水。

3、水域温度我觉得39——40度比较好，因为以前我38度复苏时，一般一分钟内不能融化细胞，细胞存活率也不好，而40度时细胞的存活率满高。

4、还有就是提醒象我这样马虎的同学，细胞冻存在4度，或－20时就忘了，我干过好几次这样的事（这几次细胞种很好，很心疼），其实可以将冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。

总之，养细胞是件及其麻烦的事情，需要超级的细心与耐心，有一点是大家需要牢记的，你对细胞的态度，与细胞对你的态度是成正比的，你糊弄它，它就不会好好给你长，或者污染，或者死亡，在时间和金钱上给你带来损失。

丁香园网友liumaf的观点为：

1、在冻存细胞的时候加大血清的比例，到复苏的时候死的细胞数相对少， 如果有条件的话用全血清冻存效果更好

2、细胞室在使用前最好用福尔马林进行熏蒸一下，比较安全，每周至少用消 毒水去擦细胞室地面一次，

3、血清从-20度中取出后要进行缓慢化冻，否则容易形成沉淀，使用前最好离心会发现有沉淀物。

4、注意血清是否需要灭活

5、配置细胞营养液的时候，PH一定要用酸度计测准确，而且有必要检测其渗透压

丁香园网友zhangjinbo0661的观点为：

1、注意喷酒精装置的应用：制作很简单，用过的化妆品，理发店理发前往头发上喷 水的瓶子及其他一些有喷水功能的瓶子，经过处理装上百分之75的酒精就可以了（我不知道有没有实验专用喷洒酒精的瓶子，如果有那就更好了）。我用的是师姐留下来的一种护肤品的瓶子。常常往超净台台面，手上喷洒酒精，效果很好。

2、我进入细胞培养室就戴上PE手套（一次性塑料薄膜手套），当在超净台操作时戴上一次性橡胶手套。

3、培养箱内水盘里的水，用灭菌的超净水，每周更换一次（至少也要两周换一次）。换水前要用百分之75酒精消毒。水浴箱也要定期消毒（用百分之75酒精）换双蒸水。

4、从培养箱内取东西前手一定要喷酒精，动作要快，可以先看好了，要取的东西在那里，然后快取。显微镜下观看细胞时间也不要过久，否则会对细胞有不利影响。

5、很多人喜欢常规用抗生素，其实除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

6、液体培养基贮存于4℃ 冰箱，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。温热前后注意酒精消毒。

7、用离心法从动物身上取细胞时， 其离心速率不要超过1000转/分钟（很多文献上都大于这个数值，但记住不要超过1000），时间一般不超过10分钟，否则会造成细胞活力下降或者死亡。

8、取出冷冻管后， 一般是放入37 °C 水槽中快速解冻。我按着师姐的经验都是放入38°C的水中，上面一些战友提到了39和40°C，不知道效果如何，希望多多交流，希望其他战友如果也有不同于37°C的，请多多跟帖，互相交流。

9、有个问题想和大家讨论一下，就是在超净台内，瓶盖口是应该朝上放，还是应该朝下放。我们知道，用酒精灯的火烧一下，不是为了杀菌，主要是形成向上的气流，防止空气中的细菌落下，如果这样的话，那么瓶盖口向上就不对了。我想台面用酒精消毒了，也用紫外灯照过了，应该是无菌的，就瓶盖口向下了，结果被师姐批评了。不知大家平时是怎样做的。