【原创】ChIP实验的一点经验
丁香园论坛
4257
最近有不少战友在做ChIP实验，希望我的一点经验对大家有帮助（本贴不谈实验步骤，最后我会附件
一份说明书，有详细步骤，另外建议像我一样的新手用试剂盒，避免不必要的麻烦）
一、原理
转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在
基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转录是必需的，但不是充分的，通常需要一些特异的转
录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平，ChIP主要用于研究转录因子（个人
认为主要是特异转录因子的作用，因为这些因子的表达才有时空特异性）与下游基因的结合，如果
ChIP发现转录因子能与目的基因结合，那么这说明该基因可能是其下游基因，要想进一步证明，还要
做高低表达和荧光素酶等实验。
二、目的基因的筛选
1，如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了，理论上芯片会分析出样本中该转录因
子所有的下游基因，我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。
2、如果是做普通的ChIP，那么在实验前要进行初步的筛选，选择自己感兴趣的目的基因，设计
PCR引物，进行验证，所以，这样考虑的话，ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为，筛选目
的基因的方法有一下几种：a，查文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能相关。b，
你的课题设计中涉及到的基因，比如说你课题中设计到c-myb基因，你就想看一下转录因子和c-myb的
关系（这个纯属碰运气）。c，根据自己早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录
因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因。
3、另外筛选完自己感兴趣的基因后，可以用一些分析工具进行初步的预测，这个网上也可以搜
到，就不罗嗦了，如果有战友需要，可以再讨论。
三、实验设计
这里只说说实验各组的作用
1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声
效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和
input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之
，说明效率低，实验条件有待改进）
2、阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，
在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择
阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带
3、阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阳性对照，
但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，个人认
为这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和目的基因组相比）
，也是不妨碍的。
4、实验组，这个就不多说了就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因
四、引物设计
1、ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况，因此引物设计要选择目的基因启动子区
，ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段（或者为了保险些选在2000bp）
，因为一般情况下，转录因子结合在这个区域，当然也有结合在更上游，或者有的文献报道在转录起
始位点下游也有结合，我们就不能一一考虑这些有点特殊的情况了，我实验的时候选择的是转录起始
位点上游2000bp的片段
2、引物设计原则跟普通的引物相同，但是，超声后DNA被打断，所以PCR产物要尽量短一些，100
多bp就足够了，因为产物长度越长，这段DNA被打断的可能性就越大，P出来的可能性就越小
五、固定与超声
个人认为虽然固定和超声只是样本的准备，但这步是实验成功的关键，也是出来漂亮结果的关键
。不同的仪器，超声的条件差别很大，所以不能单纯的按照说明书来做，要根据自己的仪器，摸索适
当的条件，另外，个人感觉超声时样本的体积不宜过大，体积过大超声容易不均匀，效果不理想，
400ul左右就完全可以（这个跟超声仪探头的直径也有关系）
六、ChIP
这是实验的主体部分，说明书对这些步骤说的已经够详细了，为了得到理想的结果，抗体孵育时
间和抗体的用量，可以适当调节，减少非特异，并最大程度的ChIP出目的基因。
作为一个新手，难免对实验的原理和操作过程有理解错误，也请各位战友批评。另外，记得以前
这个实验都是在免疫那个板块的，不知道发在这里合不合适，反正这里人气高
一份说明书，有详细步骤，另外建议像我一样的新手用试剂盒，避免不必要的麻烦）
一、原理
转录从基因的启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在
基本启动子区起始转录，而这个过程对基因的转录是必需的，但不是充分的，通常需要一些特异的转
录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平，ChIP主要用于研究转录因子（个人
认为主要是特异转录因子的作用，因为这些因子的表达才有时空特异性）与下游基因的结合，如果
ChIP发现转录因子能与目的基因结合，那么这说明该基因可能是其下游基因，要想进一步证明，还要
做高低表达和荧光素酶等实验。
二、目的基因的筛选
1，如果做ChIP-seq那就不需要在实验前筛选目的基因了，理论上芯片会分析出样本中该转录因
子所有的下游基因，我们根据这个分析结果进行筛选就可以了。
2、如果是做普通的ChIP，那么在实验前要进行初步的筛选，选择自己感兴趣的目的基因，设计
PCR引物，进行验证，所以，这样考虑的话，ChIP实验是对你的早期数据的验证。个人认为，筛选目
的基因的方法有一下几种：a，查文献，看转录因子和哪些基因在表达时间，空间，及功能相关。b，
你的课题设计中涉及到的基因，比如说你课题中设计到c-myb基因，你就想看一下转录因子和c-myb的
关系（这个纯属碰运气）。c，根据自己早期的实验结果，比如，你做高、低表达后，发现你的转录
因子表大变化后，一些基因的表达也发生了变化，那么这些基因可以作为候选基因。
3、另外筛选完自己感兴趣的基因后，可以用一些分析工具进行初步的预测，这个网上也可以搜
到，就不罗嗦了，如果有战友需要，可以再讨论。
三、实验设计
这里只说说实验各组的作用
1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声
效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和
input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之
，说明效率低，实验条件有待改进）
2、阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，
在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择
阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带
3、阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阳性对照，
但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，个人认
为这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和目的基因组相比）
，也是不妨碍的。
4、实验组，这个就不多说了就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因
四、引物设计
1、ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况，因此引物设计要选择目的基因启动子区
，ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段（或者为了保险些选在2000bp）
，因为一般情况下，转录因子结合在这个区域，当然也有结合在更上游，或者有的文献报道在转录起
始位点下游也有结合，我们就不能一一考虑这些有点特殊的情况了，我实验的时候选择的是转录起始
位点上游2000bp的片段
2、引物设计原则跟普通的引物相同，但是，超声后DNA被打断，所以PCR产物要尽量短一些，100
多bp就足够了，因为产物长度越长，这段DNA被打断的可能性就越大，P出来的可能性就越小
五、固定与超声
个人认为虽然固定和超声只是样本的准备，但这步是实验成功的关键，也是出来漂亮结果的关键
。不同的仪器，超声的条件差别很大，所以不能单纯的按照说明书来做，要根据自己的仪器，摸索适
当的条件，另外，个人感觉超声时样本的体积不宜过大，体积过大超声容易不均匀，效果不理想，
400ul左右就完全可以（这个跟超声仪探头的直径也有关系）
六、ChIP
这是实验的主体部分，说明书对这些步骤说的已经够详细了，为了得到理想的结果，抗体孵育时
间和抗体的用量，可以适当调节，减少非特异，并最大程度的ChIP出目的基因。
作为一个新手，难免对实验的原理和操作过程有理解错误，也请各位战友批评。另外，记得以前
这个实验都是在免疫那个板块的，不知道发在这里合不合适，反正这里人气高
