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scFv 表面表达的培养和诱导

相关实验:流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验

最新修订时间:

简介

建立单链抗体可变区基因片段(scFv)酵母菌表面表达文库,特异性地设计 scFv 文库,以展示全长 scFv 抗体,该抗体表达在酵母菌细胞表面,可以通过 N. 末端 HA 或 C. 末端 c-myc 抗原决定簇位点标签来监测。这些抗原决定簇位点使利用流式细胞仪检测在表面表达全长 scFv 克隆基因的文库, 或细胞株成为可能。

材料与仪器

器材:恒温培养箱等。

试剂:

①营养丰富的非选择性培养基 YEPD 或 YPD(酵母提取物蛋白豚葡萄糖):10 g/L 酵母提 取物,20 g/L 蛋白腺,20 g/L 葡萄糖。过滤除菌或高压灭菌。

②选择性生长培养基(SD + CAA):5 g/L 酪蛋白氨基酸(腺瞟吟,尿嗜嚏,色氨酸),20 g/L 葡萄糖,1.7 g/L 不含硫酸铉和氨基酸的氮碱基发酵粉(Difco 牌,目录编号 233520,BD 公司,富 绕林湖,新泽西州),5.3 g/L 硫酸铉,10. 19 g/L Na2HPO4 • 7 H2O,8. 56 g/L NaH2PO4 ・ H2O(JAL 注释 4.2)。

③选择性 scFv 诱导培养基(SG/R + CAA):除了 20 g/L 半乳糖,20 g/L 棉子糖和 lg/L 葡 萄糖替代葡萄糖外,其他与选择性生长培养基相同。

④琼脂平板: 在 YERD 中加入 20 g/L 琼脂,SDA-HUT(合成的含组氨酸、尿嚼喘、色氨酸 的琼脂)。订购或自己配制(我们的供应厂商是 Teknova,Half Moon Bay ,CA)。

步骤

scFv 表面表达的培养和诱导的基本过程可分为如下几步:

(一)scFv 文库

A 开始包含基因文库多样性的 10X 最小容量酵母菌的 SD + CAA 培养, 对于 109 个不同文库,需要 10"株酵母菌进行培养。培养物为 1L, 浓度为 0. 5 OD600/mlo 用于验证克隆形成单位和排除细菌污染的推荐方法是稀释平皿培养法。

B 30℃ 震荡生长过夜, 从培养物和片状沉淀物的多样化基因文库中取 10X 代表物,如果多样性为 109 个克隆,则一个 10X 代表物即为 1010 株酵母菌。意味着浓度为 2x107 酵母菌/OD600 单位时,需要 500 OD600。例如,如果 0D 值是 5.0 OD600/ml, 则获得 1010 株酵母菌需要 100 mL 培养物。一般来说,培养物应新鲜饱和的或<4 OD600/mL

C SG/R + CAA 重悬细胞沉淀物用至 0.5 OD600/mL,20℃ 震荡孵育至浓度倍增 1〜2 倍,浓度测定用 OD600。以上通常需要 12〜16 h。

D 将酵母菌在清洗缓冲液中洗涤 1 次。现在可以用生物素化抗原标记酵母菌, 然后在磁柱上富集纯化。也可以放置于烧瓶中,4℃ 保存 1 周,c-mgc 表达水平降解最小,用流式细胞术检测阳性细胞。然而,酵母菌变得具有黏性且倾向于聚集成团,从而影响筛选,同时活力往往减少 50%。

(二)个体 scFv 克隆

A 从单个分离的酵母菌菌落中取菌加入 1〜5 mL SD+CAA 培养基中进行培养。
B 30℃ 震荡培养过夜。

C 在 1〜5 mL SD+CAA 培养基中接种足够多的细胞,起浓度为 0.5 OD600/mL。

D 用 SG/R + CAA 重悬细胞团至浓度为 0. 5 OD600/mL,20r 震荡孵育至浓度倍增 1〜2 倍,浓度测定用 OD600,以上通常需要 12〜16 h。

E 在流式细胞术染色前用清洗缓冲液洗涤细胞 1 次,或将细胞用烧瓶 4 无保存 1 周。 参见小标题(一)scFv 文库, 第 D 步诱导培养物的 4℃ 贮存。

来源:丁香实验

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