Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集

Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集对 109 多样性的非免疫文库中抗原特异性克隆的富集处理。

器材：

Miltenyi 磁激活细胞分选法（MACS）所用 LS 磁珠分离柱、链霉亲和素标记磁珠（或抗生物素磁珠）、手工磁力分选仪（Miltenyi 生物技术公司 Biotech，奥本，加州）、离心机等。
试剂：

①生物素化抗原

Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集的基本过程可分为如下几步：

A 用 10 mL 洗涤缓冲液重悬 1×1010 酵母菌（取自诱导培养物）。

B 加入 1 种或多种生物素化抗原，其终浓度为 100 nM。在 25℃（室温）孵育 30 min, 再冰浴 5~10 min下面所有步骤均需使用冰预冷后的缓冲液或在 4℃ 进行。

C 离心细胞（3 000 g 离心 3 min）并用 50 mL 洗涤缓冲液洗 3 次。

D 用含 200 μl MACS 链霉亲和素磁珠（或抗生物素磁珠）的 5 mL 洗涤缓冲液重悬细胞团。在随后的多轮筛选中交替使用这些磁珠，以减少获得续发的试剂特异性克隆的机会。

E 轻轻混匀，冰浴 10 min，每 2 min 翻转 1 次。

F 预处理 Miltenyi LS 柱，利用重力使 3 mL 用冰预冷的洗涤缓冲液流过以装入磁体。

G 加入 40 mL 清洗缓冲液，离心细胞并用 50 mL 洗涤缓冲液重悬。在将其马上载入 Milte-nyi LS 柱前先将细胞涡旋混匀，并使其通过 1 个细胞过滤管（Falcon 牌，cat．no．352 235，BD Bi-osciences，圣何塞，加州），以确保细胞为单细胞悬液。

H 加入 7 mL 细胞悬液，使其通过细胞过滤器进入柱内。当 7 mL 细胞进入柱内后，中止液流，将 LS 柱从 MACS 中撤离，又迅速放回。这样使柱中的钢珠重新排列，从而细胞陷入两个钢珠之间才能通过。当柱子重新进入磁体，加入 1 mL 洗涤缓冲液并使其流过，然后再加入 7 mL 细胞到柱上。在每次加入细胞之间重复移走柱子，加完全部 50 mL 细胞大约需要 30 min。

I 一旦所有细胞均已加入 LS 柱中，即用 3 mL 洗涤缓冲液洗柱，确保上面填充室所有残余细胞均被洗净，这次清洗将柱体空隙中的细胞均洗去。将 LS 柱从磁体中移走，又迅速放回原处，再重复该清洗步骤 2 次。

J 一旦 LS 柱停止滴液，从磁体中移走 LS 柱，然后加入 7 mL 洗涤缓冲液，并用配套针芯将所有剩余细胞推出并转入 1 个 15 mL 圆锥形试管。我们一般能洗脱（1～3）x107 细胞，离心细胞并按以下步骤重悬：

①如果是第 1 轮筛选：在 200 mL 选择培养基（含青霉素或链霉素的 SD＋CAA）重悬酵母菌，并过夜生长使其饱和（1010 个酵母菌），平板稀释法以获得分离酵母菌的准确数量。这就是 R1 产出量的多样性，SG／R＋CAA 诱导如前所述。第 1 轮筛选允许文库的最大限度扩增和目的克隆随后可重复用磁珠进行富集。再使用抗生物素磁珠如上所述进行第 2 轮筛选，即为 R2 产出。

②如果是第 2 轮筛选（用磁柱进行第 2 次富集）：用 500μl 缓冲液重悬细胞，标记后用流式细胞术进行分选。