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启动子转录活性分析

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

目前,用于启动子转录活性分析的方法主要有3种:报告基因技术分析启动子转录活性、核实时转录分析技术和cDNA的 5’-快速扩增技术分析启动子转录活性。

原理

根据实验方法不同,对应的原理也有所不同:


报告基因技术的基本原理是将一些表达产物极易直观检测的结构基因,如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、半乳糖苷酶(LacZ)的基因编码序列连接在需要研究的任何特定启动子(如TNF-α基因启动子)的下游,替代原有的结构基因。


将这一融合基因放回细胞内,通过荧光检测或其他呈色定量检测表达产物,就可以直观地“报告”TNF-α基因启动子等特定启动子在细胞内的转录活性及各种细胞内外信号的影响。荧光素酶、绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶等用于该项技术的基因被称为报告基因。


核实时转录分析技术的基本原理是在试管内,向细胞核提取物中加入放射性核素标记的NTP, 使其掺入到正在转录的 mRNA 分子中;再通过核酸分子杂交的方法,即可以同时鉴定出多个目标基因是否转录以及其转录的量。


该方法作为一种比较可靠的测定转录活性的方法,能够排除 Northern 印迹等方法中 mRNA 的半衰期对实验结果的影响,可同时分析多个基因的转录活性。


cDNA的 5’-快速扩增技术的基本原理是首先利用待研究的 mRNA 或 ncRNA 中已知的序列设计一条基因特异性引物 (gene-specific primer, GSP), 并以该转录本为模板进行反转录得到 r:DNA 的第一链;


接着在末端脱氧核糖核酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl tranferase, TdT ) 的催化下将 dATP 逐个加到新合成的 rDNA的 3'- 端,形成 polyA; 再利用含有部分接头序列的通用引物 (universal amplification primer,UAP ) 和GSP 分别作为上游引物和下游引物、经PCR扩增获得已知信息区和 polyA 尾之间未知的5'-端的 RNA 序列。


为(提高扩增的特异性,还可以再设计一条巢式基因特异性引物 (nested gene-specific primer, NGSP) 和接头引物来进行第二轮的PCR。

来源:丁香实验团队

操作方法

报告基因技术分析启动子转录活性

报告基因技术分析是将一些表达产物极易直观检测的结构基因,如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、半乳糖苷酶(LacZ)的基因编码序列连接在需要研究的任何特定启动子(如TNF-α基因启动子)的下游,替代原有的结构基因。常用于转录调节研究。

核实时转录分析技术

核实时转录分析技术是用来直接研究真核细胞内目标基因的实时转录效率的方法。

5’-快速扩增技术分析启动子转录活性

cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA end, RACE ) 是一种基于PCR反应的,对cDNA的5'-端或3'-端的有效扩增技术。

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