报告基因技术分析启动子转录活性

报告基因技术分析是将一些表达产物极易直观检测的结构基因，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、半乳糖苷酶(LacZ)的基因编码序列连接在需要研究的任何特定启动子（如TNF-α基因启动子）的下游，替代原有的结构基因。常用于转录调节研究。

报告基因技术分析的基本原理是将一些表达产物极易直观检测的结构基因，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、半乳糖苷酶(LacZ)的基因编码序列连接在需要研究的任何特定启动子（如TNF-α基因启动子）的下游，替代原有的结构基因。

将这一融合基因放回细胞内，通过荧光检测或其他呈色定量检测表达产物，就可以直观地“报告”TNF-α基因启动子等特定启动子在细胞内的转录活性及各种细胞内外信号的影响。

报告基因技术可用于多种转录调节研究。可以分析启动子的基本活性、可以在所研究的启动子上游或下游插入各种顺式调节元件，观察它们对启动子活性的影响、可以观察细胞内各种信号（如蛋白激酶、转录因子的活化等）对所研究启动子的转录活性的影响。

器材：

发光仪。

试剂：

①含有荧光酶素报告基因的质粒

细胞裂解液：1.25 ml 1 mol/L Tris-HCl(pH7.5), 25 µl 1 mol/L DTT, 250 µl 10% TritonX-100,加水至25 ml,4 ℃保存。

转染试剂。

②ATP溶液：1.25 mllmol/L Tris-HCl(pH7.5), 250 µl

1 mol/L MgCl₂, 24 mgATP, 加水至10 ml,-20 ℃保存。

报告基因技术分析的基本过程可分为如下几步：

A.实验第一天，消化并接种细胞（根据具体实验选择合适的细胞）于35mm细胞培养皿，置于5% CO₂、饱和湿度的37 ℃培养箱内培养过夜。

B.待细胞密度达到60% ~70% 时，用荧光素酶报告基因质粒转染细胞。

C.转染24~36 h后，吸去培养液，用冰冷的PBS洗涤细胞。

注意事项：荧光素酶的酶促反应会被痕量的钙所抑制，故用磷酸钙转染的细胞在收集细胞前应充分洗涤除去含钙介质。

D.在每个培养皿中加入350 µl预冷的裂解液，于4 ℃或冰上放置10 min 裂解细胞。

E.在细胞裂解期间，准备足量的1.5 ml微量离心管，将ATP缓冲液与荧光素缓冲液以1:3.6的比例混合后分装，每管100 µl。

F.依次取等体积的细胞裂解液(100 µl)至步骤E中的离心管内，迅速混匀，在发光仪上读取吸光度值。

注意事项：发光反应会迅速衰减，将细胞裂解液加入反应液后5 s内必须读取吸光度值，确保以相同操作手法读取全部样品的吸光值。

G.取剩余裂解液测定lacZ的活性，其读数作为内标用以矫正荧光素酶的读数。用矫正后的读数作图，分析数据。

2. 荧光素见光易氧化，已稀释未用的荧光素应丢弃。

3. 由于荧光检测的条件受很多因素影响，每次的荧光读数可能有较大的差别，报告基因启动子活性检测往往以相对值来表示，这就要求每次实验应该包含尽可能多的对照载体。

所有对照载体的构建应该和实验载体一样，在实验开始前就完成设计和构建。等实验开始以后，不断地想起还缺哪个对照，再去构建，往往造成实验的多次不必要的重复。

4. 在设计载体时，特别要注意设立好各种对照，包括不同长短的启动子、转录因子结合位点的缺失或点突变的突变体等 ，以保证利用这一套载体，可以确切地证实某种特定的转录因子能够结合在启动子上，激活报告基因的表达，而突变的启动子将丧失这种结合能力。