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核实时转录分析技术

相关实验:启动子转录活性分析

别名:nuclear run-on transcription assay

最新修订时间:

简介

核实时转录分析技术是用来直接研究真核细胞内目标基因的实时转录效率的方法。

原理

核实时转录分析技术的基本原理是在试管内,向细胞核提取物中加入放射性核素标记的NTP, 使其掺入到正在转录的 mRNA 分子中;再通过核酸分子杂交的方法,即可以同时鉴定出多个目标基因是否转录以及其转录的量。


该方法作为一种比较可靠的测定转录活性的方法,能够排除 Northern 印迹等方法中 mRNA 的半衰期对实验结果的影响,可同时分析多个基因的转录活性。

用途

核实时转录分析技术可用于可以直观检测某一时间点的基因转录效率;同时由于核质分离,避免了一部分 mRNA 进入胞质内进行翻译。所以,这是真正能够实现观察目标基因是否在转录水平受到调控的重要方法。

材料与仪器

器材:


离心机、NC膜、杂交炉。


试剂:


①细胞核裂解液、细胞核储存液 ;
②cDNA探针、NaOH、乙酸胺;
③32P标记的NTP、DNase I 、细胞核终止液、蛋白酶K、tRNA、TCA溶液、无水乙醇、TE缓冲液、10 x Denhardts 溶液、反应缓冲液。

步骤

核实时转录分析的基本过程可分为如下几步:


(一)分离细胞核


A.培养适当密度细胞,用预冷的PBS洗涤细胞2次,吸干净余液。加适合体积的PBS,将细胞刮下,收集6X106个细胞。


B.4 ℃、500 g离心5-8 min,小心吸掉上清。


C.加入适量体积细胞核裂解液,涡旋混匀15 s,立即置于冰上10 min。


D.4 ℃、500 g离心5-8 min,小心吸掉上清。


E. 加入与沉淀体积大致相等的细胞核储存液(50-200 µl), 小心重悬沉淀,-80 ℃存储。


注:细胞核裂解液:10 mmol/L NaCl, 3 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L Tris-HCI(pH7.4), 0.5% NP-40。细胞核储存液:40% 甘油,50 mmol/L Tris-HCI(pH8.5), 5 mmol/L MgCl2 ,0.1 mmol/L EDTA。


(二)杂交膜的制备


这一过程是将待检测基因的cDNA探针固定到杂交膜上:利用NaOH变性;加入等体积的乙酸胺中和反应;在NC膜上制备样点。


(三)核转录反应


A.制备2 X反应缓冲液:


[γ-32P]-UTP(1.85x1010 Bq) 50 ul
4X反应缓冲液 250 µl
8XNTP混合液 125 µl

ddH2O 75 µl


B.冰上融解细胞核储存液,小心吸取50 µl至50 µl 2X反应缓冲液中,室温反应20 min。


C.加入2 µl DNase I, 37 °C孵育10 min。


D.加入300 µl细胞核终止液、300 µg蛋白酶K和100 µg tRNA,用移液器混匀,40-50 °C孵育2 h。


E.加入预冷的50% TCA至每个样品,终浓度为10% ,冰浴10 min。


F.4 °C、12000 r/min离心15 min,小心吸弃上清。


注意事项:小心弃上清,提前打开离心机降温。


G.100% 乙醇洗涤核酸沉淀,离心,吸弃乙醇,风干。


H.加入含0.5% SDS的TE缓冲液50 µl, 65 ℃ 孵育15~30 min,充分溶解沉淀。


I. 制备新鲜的杂交缓冲液,将结合探针的NC膜浸泡于2.5 ml杂交缓冲液中,42 ℃孵育6 h。


J. 加入50 µl制备的RNA样品于杂交缓冲液中,42 ℃孵育72 h。


K.洗涤杂交膜:先用含0.2% SDS的6 x SSC洗涤1次,再用含0.2% SDS的2 x SSC洗涤2次,每次室温洗涤10 min;然后用含0.2% SDS的2xSSC洗涤2次,每次65 ℃洗涤10-30 min。


L.取出杂交膜,利用放射自显影检测结果。


注:4X反应缓冲液:100 mmol/L HEPES缓冲液(pH7.5), 10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L DTT,300 mmol/L KCL, 20% 甘油。

8 X NTP混合液:2.8 mmol/L ATP、GTP、CTP和3.2 mmol/LUTP。


细胞核终止液:2% SDS,7 mol/L尿素,0.35 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)。


杂交缓冲液: 50% 甲酰胺,6 X SSC,10 x Denhardts溶液,0.2% SDS。


10 x Denhardts溶液:1% 聚蔗糖,1% 聚乙烯吡咯烷酮,1% BSA。


(四)杂交反应


杂交反应是根据具有同源性的DNA或RNA单链在一定条件下碱基互补配对的原则进行的。

注意事项

1. 分离细胞核的过程需要提前准备充足数量的细胞,操作时,一方面要保证获得细胞核的纯度,不要混杂过多胞质或胞膜碎片;另一方面要小心谨慎,防止损伤核膜,保证细胞核的完整性。


要得到高质最的核转录分析数据,需要制备足量的细胞核提取物,用1X107个细胞的核提取物可以获得最佳数据,但是用1X106个细胞已可以检出。


2. 将NC膜在杂交炉中孵育,以固定探针于NC膜。cDNA探针的设计对于此实验至关重要,在保证mRNA与探针结合的同时还要具有足够的特异性;另外,探针浓度应该适当,浓度过高会增加背景,浓度过低又会导致敏感性下降。操作过程中还要注意保证各位点之间的距离,防止交叉污染。


3. 核转录反应是本实验的关键步骤,将分离获得的细胞核置于缓冲液中,通过模拟体内的环境使得转录过程持续进行,由于使用的是32P标记的NTP, 新合成的RNA链也将被标记32P根据信号的强弱便能够确定RNA的表达水平。


在这一过程中,反应缓冲液成分影响转录过程的顺利进行:

①缓冲液中各种离子的浓度和比例对于保持细胞核形态非常重要,如K+和Mg+浓度过低会导致核内DNA的渗出;


②pH值影响转录效率,pH值等于8时转录效率最高,当降低到6.7时,转录效率会降低一半;


③缓冲液中NTP浓度也影响RNA的生成,而缺氧条件会减少ATP的含量。因此,反应缓冲液需要精确并新鲜配制,以保证转录过程的顺利进行。


4. 影响杂交过程的因素很多,主要包括:


探针的特异性和浓度、杂交缓冲液盐和甲酰胺的浓度、杂交温度。严格来说,实验前应该通过预实验确定与探针配比关系合适的缓冲液条件和杂交温度。

来源:丁香实验

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