5’-快速扩增技术分析启动子转录活性

cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA end, RACE ) 是一种基于PCR反应的，对cDNA的5'-端或3'-端的有效扩增技术。

cDNA 5’-末端快速扩增技术的基本原理是首先利用待研究的 mRNA 或 ncRNA 中已知的序列设计一条基因特异性引物 (gene-specific primer, GSP)，并以该转录本为模板进行反转录得到 r:DNA 的第一链；

接着在末端脱氧核糖核酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl tranferase, TdT ) 的催化下将 dATP 逐个加到新合成的 rDNA的 3'- 端，形成 polyA; 再利用含有部分接头序列的通用引物 (universal amplification primer，UAP ) 和GSP 分别作为上游引物和下游引物、经PCR扩增获得已知信息区和 polyA 尾之间未知的5'-端的 RNA 序列。

为（提高扩增的特异性,还可以再设计一条巢式基因特异性引物 (nested gene-specific primer, NGSP) 和接头引物来进行第二轮的PCR。

cDNA的5 '-端快速扩增技术用于分析转录起点和启动子序列。

器材：

涡旋震荡仪、水浴锅、切胶仪。

试剂：

①第一链缓冲液，5X、DTT(20 mmol/L)、dNTP混合液(10 mmol/L)、SMARTer IIA oligo ;

②5'-RACE cDNA合成反应液：RNA酶抑制剂(40 U/µl) 、SMARTScribe反转录酶(100 U) ;

cDNA的5 '-端快速扩增技术的基本过程可分为如下几步：

A.首先按下表为每个cDNA合成反应配制混合液，短暂离心后于室温放置，直至步骤E:

总体积 4.0 µl

B在1.0~2.75 µ1的总RNA中加入1.0 µl的5'-CDS引物A(试剂盒专配），用无菌水补足至3.75 µl，混合均匀并短暂离心。

C.72 °C水浴锅中加热3 min,接着放置于42 ℃环境冷却2 min, 14000 g短暂离心以收集管盖上的残留液体。

D.加入1.0 µl的SMARTer IIA oligo,振荡混合均匀并短暂离心。

E.按下表配制5'-RACE cDNA合成反应液：

总体积 5.25 µl

F. 将步骤D和步骤E中得到的溶液，混合，此时反应总体积为10 µl。

G.于42 ℃孵育90 min后放入70 ℃ 水浴锅中加热10 min。

注意事项：水浴锅提前加热；

H. 短暂离心，将cDNA合成产物用TE缓冲液稀释（若用于合成反应的RNA总量小于200 ng, 加入20 µl的TE; 若大于200 ng, 则加入100 µl的TE)。

I.以上述得到的cDNA为模板，以UAP和GSP分别作为上下游引物，进行PCR反应。