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qPCR 问题全解析
qPCR 问题全解析
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问
请问qpcr扩增曲线溶解曲线都是锯齿状的是什么原因啊？
土井挞克树
实验操作问题：PCR反应管没有盖紧，反应液泄露；PCR反应液有挂壁模板问题：RNA纯度低，扩增信号太弱仪器本身的问题：长时间未校正，荧光不稳定；使用过度，荧光收集不稳定
4 回答
716 围观
问
qpcr 内参ct值在15-25左右，但是目的ct值在31左右。怎么解决ct值过高问题，数据是否能用？
bamboopiggy
内参在15-25，目的在31是可以的，但是数据能不能用要看melt curve
3 回答
5411 围观
问
QPcr 260/230
dxyc42u
虽然260/230有点低，但你的260/280的还好着，主要看这个，所有没问题可以用
3 回答
2356 围观
问
用质粒做qPCR的时候，低浓度的不同稀释倍数质粒（1undefined4-1undefined1copies/ul）CT值结果很接近，是质粒稀释的问题吗？要
土井挞克树
考虑质粒本身浓度太低，所以稀释后ct值拉不开，很接近。
4 回答
1123 围观
问
qpcr ct值高
sswei
有几个可能性。1、最有可能是RNA降解严重。2、逆转可能出问题，可能是逆转试剂有问题，也可能逆转程序没设置好，也可能是逆转前RNA没有预热变性。3、有DNA污染，可能在抽提的时候有DNA混进去了。
3 回答
665 围观
问
qPCR | Undetermined
z流沙z
部分目的基因表达量低，就没有测出来，这些基因就不适合稀释
3 回答
3890 围观
问
qPCR内参Ct值
橙汁儿青柠味
模板cDNA稀释的比较多所以内参的ct值比较大，然后目的基因的表达丰度比较高，所以ct值比内参小
3 回答
1105 围观
问
求大家帮我分析分析qPCR失败的原因😭
Topmicro
提取和反转完跑个胶或者检测一下浓度
3 回答
369 围观
问
qPCR每次做结果都不一样，大多时候各组没有差异，怀疑QPCR不准
土井挞克树
先检查体系是否有降解，每次都不一致的话最可能的就是体系存在降解问题。
4 回答
1228 围观
问
qPCR需要保证每个样本的CDNA浓度一致吗？
土井挞克树
不需要完全一致，保持稀释倍数一致很重要
4 回答
3639 围观
问
请教QPCR 上样顺序？
balalaLy
中途不需要离心的，全部加完贴膜之后再离心就行了。
5 回答
1369 围观
问
qpcr溶解曲线异常
Junego
1.看NTC的熔解曲线是不是和目的基因的峰值有差异，如果不同，说明是非特异性扩增。也可以将产物跑电泳看看条带是否大小不同。2.如果1中熔解曲线相同，可能有气溶胶污染。看一下Ct值差异，如果NTC和目的基因Ct值差10以上，可以分析一下相对表达量。
8 回答
1000 围观
问
Qpcr求助，求问老师，有遇到过这种大部分ct值 undete的情况吗？
dxyc42u
你这溶解曲线有非特异性扩增，好好排查下
3 回答
363 围观
问
qPCR阴性曲线为什么这样
sswei
可能的原因是：污染；引物二聚体。最好电泳确认下。如果是探针法，可能的原因基本上是污染。如果是引物二聚体，那么适当调低引物的加量，如果始终有引物二聚体峰，而且认为有影响的话，那么只能更换引物。如果是污染，那么要注意以下方面的操作。模板添加区和混合液配制区最好分开。做PCR时，在混合液配制区直接把阴性的管子盖给盖上，然后将分装好的各个管子拿到模板添加区，按照低浓度到高浓度的顺序添加。加模板时，每次都要
4 回答
398 围观
问
qPCR重复性不好，怎么避免？
天一湖医者
造成qPCR实验重复性不好的原因有以下几点：① 移液枪不准，加样不准确这种情况下，我们可以更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中② 定量PCR仪在不同位置温度不一样这个需要定期校准定量PCR仪③ qPCR预混液未混合均匀使用前应充分混匀qPCR预混液
4 回答
893 围观
问
qPCR熔解曲线都是乱的，荧光信号强度也不高，9个孔4个过不了阈值没Ct，为什么？
Eason老歌迷
可能是反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。也可能是试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。或者是仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养可能是。耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。
4 回答
316 围观
问
qpcr同一样本的三个复孔，A产品八联管做重复性很好，B产品重复性很差，但是师姐用B产品做重复性没有问题，那问题出在了哪
whilt-shirt
有可能是人为操作的差异，建议多次重复
3 回答
408 围观
问
做qpcr时，为什么基因检测出了结果，但是内参都没有检测出来？？？
balalaLy
内参引物降解了？内参使用太久会失效的。
3 回答
233 围观
问
qpcr ctsd值大于0.5的数据能用么？ 怎么解决该问题
土井挞克树
不建议用，大于0.5容易得出阴性结论。
3 回答
1118 围观
问
动物组织qpcr跑不出来
dxy_c430nxh5
可以排除仪器，操作，试剂的问题那就是实验设计的问题了，你前后换了组织，该组织里面可能不含有你想要的目的基因，内参基因能出来是正常的，因为它存在所有的组织里面，但是你得目的基因不一定存在你后面的组织里面
4 回答
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