qPCR重复性不好，怎么避免？

造成qPCR实验重复性不好的原因有以下几点：

① 移液枪不准，加样不准确

这种情况下，我们可以更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中

② 定量PCR仪在不同位置温度不一样

这个需要定期校准定量PCR仪

③ qPCR预混液未混合均匀

使用前应充分混匀qPCR预混液

同一实验设计的所有样本需取材部位/时间完全一致。选取大小均一，生长条件和遗传背景一致的供试材料。 同一种处理严格按照实验设计，处理剂量一致。

起始样本量尽量一致，不要超过试剂盒规定的范围。

把控RNA提取的整个流程，防止RNA降解。

跨外显子设计定量引物，使基因组序列不被扩增。

选用具有去除基因组功能的RNA提取试剂盒。

选用具有去除基因组功能的反转录试剂，消除基因组的影响。

倍比稀释cDNA模板减少PCR抑制剂的影响。

采用适宜的离心柱法试剂盒提取RNA，以提高RNA纯度。

加样前混匀cDNA，用好一点的枪和枪尖。

重复性差的原因有：

1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。