陌上花开1586
荧光定量PCR 三步法
RNA已经标齐到1μg/μl
逆转录之后20μl体系稀释到60μl
为什么Undetermined和低CT值同时出现了?
应该降低模板浓度吗?难道是降解了?
z流沙z
部分目的基因表达量低,就没有测出来,这些基因就不适合稀释
毛利小五郎的徒弟
考虑是存在降解,不建议降低模版浓度,可以重新来一遍试一下
loveliufudan
Undetermined和低CT值同时出现可能有多种原因,下面列出几个可能的原因:
模板浓度过高。当模板浓度过高时,荧光信号会饱和,超过荧光仪的检测范围,导致CT值无法计算,同时也会导致低CT值的出现。
质量差的RNA。如果RNA质量不好,可能会导致部分反应无法进行或引起不良反应。
退火温度或时间不合适。不同引物的最佳退火温度不同,如果温度太高或时间太长,可能会导致非特异性扩增。
针对以上情况,建议进行以下操作:
调整模板浓度。如果荧光信号饱和,可以尝试将模板浓度适当稀释,再进行PCR扩增。
检查RNA质量。使用质量好的RNA可提高反应的可靠性和准确性。
优化PCR反应条件。尝试调整退火温度和时间,选择最适合的PCR条件。
另外,如果出现Undetermined和低CT值,可以考虑进行再次检测,同时可以进行重复实验来验证结果的准确性。
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