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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
玉米种子胚乳和果皮怎么样能更快速的分开,以降低RNA的降解?
迟C迟
是需要提取胚乳的RNA吗?我们一般取未成熟样品,在冰上用镊子挤出胚乳迅速放入液氮,提RNA问题不大。
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问
RFect系列siRNA转染试剂细胞浓度要求是多少?
dxywode
我实验合siRNA使用说明:siRNA工作浓度般10-100nM我准备用50nM做转染相同孔板同量siRNA加转 染试剂量相同所我觉存质粒DNA转染与转染试剂比例同影响转染效率问题siRNA能效干扰目蛋白表达加 量越应该沉默效越.合siRNA比较贵加花费合siRNA体外瞬转染干扰效致能维持2-5左右。
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问
Single-nucleus RNA-seq没有线粒体基因了是吗?
万千490
1.线粒体由于含有自己的DNA等并能进行自我复制和转录、合成蛋白质而成为一套完整的核外遗传系统。 2.线粒体的结构物质,除部分可以自身合成外,同时又要依靠核DNA遗传系统的输入,是一种半独立性的细胞器。 3.真核细胞内所具有的两种遗传体系是处于互相影响、互相依存的复杂矛盾状态之中,核DNA遗传系统看来是居于主导地位
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问
Rna提取提纯实验中,用来溶解RNA的DEPC水 是否要经过高压处理
迟C迟
商业化的DEPC水不需要再处理。注意分装使用,以防污染。
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问
原核表达中,IPTG诱导过程中,有必要摸诱导温度吗,一般最适多少度啊?
dxy_gwrp7ndq
建议室温和37度,做时间曲线(0,1,3,5,过夜),IPTG用0.2mM,电泳检测
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问
核酸电泳跑胶量的问题
dxy_rzhv86ar
我是用5ul的上样与3u的rna 混一个点一个
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问
组织小浓度低时RNA提取纯度问题
迟C迟
肯定影响后续实验的,可以多提几次,富集一下RNA,同时保证纯度,才能保证后续实验质量,不然做了也是白做。
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问
rna的二级结构对全长rna反转录有何影响?怎样排除影响因素?
dxy_gwrp7ndq
AMV在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍
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问
怎样减少值 RNA 酶污染的机会?
dxy_gwrp7ndq
必须确保与纯化的rna接触的每一样东西都是无rnase污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如rnase喷雾清除剂处理过,去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的rnase污染,可以用rnasafe。必须保证一直使用无rnase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。
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问
miRNA相关试验如何开展呢?
dxywode
miRNA已成为研究的大热门,也是近年来国自然申请标书中的香饽饽。关于miRNA的研究,基本脱离不了以下几步:1、初步小样本测序或者芯片或者panel,这个筛选,当然,一般还会伴随mRNA的差异筛选 2、大样本PCR验证 3、功能研究(细胞和动物模型)
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问
如何通过数据库查找RNA的结合蛋白
迟C迟
RBPDB(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)是RNA结合实验的数据库,包括人、小鼠、蝇和蠕虫4类物种,总共包含272个RBPs的结合数据,包括71个具有位置权重矩阵格式的基序的结合数据,以及36组免疫沉淀实验获得的体内结合转录本序列。
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问
RNA逆转录应该在哪个区?
闭门羹牛
在扩增区,同时避免发生交叉污染
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问
RNA干扰后,荧光强度可以直接表征转染效率吗
迟C迟
可以大概看下转染效率,但是推荐更具有信服力的检测方法:1. PCR检测mRNA水平的沉默效果,一般推荐在48h到72h检测,48h比较理想,需要具体的摸索时间。PCR检测沉默效果时,在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧,而不是在同侧。这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。另外,即使设计在两侧,也不要离沉默位点太远的地方,不然可能会造成对沉默效果的低估
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问
死细胞对rna提取有影响吗
whilt-shirt
死细胞影响不大,在提RNA过程中主要还是看活细胞
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问
为什么提取RNA的时候一定要分层?如果不用分层就能提取出RNA,这样在吸取含有RNA的水相时就不怕污染了。
whilt-shirt
提RNA过程中分层是因为加入氯仿,氯仿会从trizol中萃取RNA,在吸上层的时候可以考虑不完全吸掉。如果经费充足的话可以考虑柱法提RNA,这种方法污染小。
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问
使用同一种trizol试剂盒提取RNA,条件也一致,但产量总是不稳定。是因为每次加试剂量有差异,导致离心时没有甩干的缘故吗?
vae1476
你的样本每次是否一样呢,如果需要排除一下条件,可以每次加入一个质控样本,进行对照
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问
如何高效的向原代细胞转染SiRNA?转染试剂?转染时间?
bqejjh123
选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实验有很大影响,它直接影响实验的结论和结果,因此必须选择低毒性转染试剂,以观察转染试剂的毒性是否较低。有一个简单的方法,看转染的过程和要求,比如要求的细胞密度越大,说明毒性越大,
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问
如何提高纯度,试剂盒过柱提取结果不太理想
whilt-shirt
加洗涤液多洗几遍,多过几次柱子试试。
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问
RNA干扰技术有什么缺点
上海欧易
RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型,是进行分子机制实验中最常用的实验技术。目前,RNA干扰方式主要集中在两方面:化学合成的siRNAs和Vector-based shRNA。对于siRNA,其通常直接使用化学合成并转染细胞,缺点是稳定性较低,作用时间也较短;对于shRNA,其有
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问
请问为沉默效果较好,si-RNA应在细胞汇合度多少时添加为宜?
迟C迟
提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜。
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