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科研学霸天团，48小时有问必答

问血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因？

丁香实验

血浆 -是将新鲜血液加抗凝剂后离心析出的上清液.（血细胞沉降下去了），血液提取RNA 应该是在白细胞中提，首先血液中的RNA本身就少，血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分，自然更少，前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出

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问RNAi用于检验,可行吗？

hzdlj

上几周开会的时候听见了中山二院的宋尔卫研究员讲的RNAi干扰技术,加上我一直很感兴趣,也在看一些文献.会上,我请教过他这个问题,宋老师说他还没有想过这个问题(宋老师很谦虚,听他的讲座受益非浅),不过他向我说起了一个实验模型,就是把siRNA固定在一个固相载体上,然后加入肿瘤细胞,当然siRNA是针对肿瘤细胞的耐药基因设计的,培养细胞加入化疗药物,观察哪些细胞成活了,成活了的,显然不携带耐药基因,没

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问都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？

丁香实验

RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后

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问RT－PCR在RNA干扰中是否还有作用？

zhuqueleee

我觉得你的方法有点问题的。你不应该仅仅通过观察RNAi前后实验组、空白组的cDNA含量变化来监测RNAi效果，而是应当把空白组和实验组再各设一个看家基因对照，通过看家基因和目的基因的量的对比，从而观察你的RNAi效果。个人意见，希望对你的实验有所帮助。

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问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

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问设计好的引物如何在NCBI 上比对?

goleo

引物比对在ncbi主页www.ncbi.nlm.nih.gov/上点blast，然后选择左上角那个版块里的search for short，nearly exact matches，输入上游引物序列，在下一行输入下游引物序列，选择你要看的种属（没有特殊要求就选择nr），点submit，在下一个窗口中点format，就可以了。这样是看一对引物的特异性。

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问实时荧光定量试验，是否需要均一化处理？

剑藏鞘

内参的选择也很重要

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问怎么 RT－PCR 老不出结果

zhangcs

我的目的基因长度是580bp，第一次三管p出来的也是580bp，污染或杂带也不会这么巧就出现在这个位置吧，另外我用的是同一台pcr仪，同试验室的师兄也用这台pcr仪，没问题呀，至于条件，我做过很多次梯度了，循环次数也改了很多次，由于我的目的基因比较长，4500bp，而且产物片断也比较长，我怀疑是不是目的基因断成小片断了，我因此也重提了很多次RNA,但还是不行呀，我下一步该怎么办，帮帮我吧，谢谢了！

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问如何排除RT－PCR

life

结合个人实验，我觉得有两种方法可以佐证（1）如果你的正反向引物或只有一侧的引物可以设计在EXON的边缘，你可以在设计时，让一个引物的一部分跨过一个内含子，这样从DNA上是拉不到产物的，只有从CDNA上可以得到。（2）验证是否存在DNA污染，你也可以用其他已知基因的引物从DNA和CDNA拉出片段的差异来看你的模板中是否有DNA你可以结合验证，另外DNase消化时要充分

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问关于 RT－PCR 的 RNA 提取

qjm7717

用飞捷的试剂盒试试，15分钟搞定，当然组织可能稍微费时一点。

9 回答105 围观

问PCR扩增不出DNA

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

2 回答320 围观

问可重复性差，溶解曲线不一致

78 围观

问求PCR结果怎么做出这样的散点图

seuzsl

先求每个样本的2的-Δct，然后所有结果除以对照的均值，就可以作图了

1 回答661 围观

问qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

seuzsl

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，

2 回答4272 围观

问如何进行QPCR中多组数据的统计分析？

香柏树001

相对表达量，我用的是2-△△CT法，每组3各平行要有的，然后得出的Ct值，计算出2-△△CT值就可以了，这样就得出3各2-△△CT，要比较的两组之间求P值就行了。附件讲的比较详细。

1 回答196 围观

问为什么目的基因Ct值正常，反而内参的Ct值很高

杜小涛

引物反复冻融次数多了就有可能降解，不过你这个可以先考虑基因时空表达的问题，如果确定你做的这个时期和组织确定表达量并不低，就有可能是引物反复冻融导致的降解了

3 回答257 围观

问【求助】PCR实验目的基因的CT值和内参的CT值接近

冰雪芙儿

CT值高，提高模板浓度就行了，我最近也在做，刚开始稀释发现CT值很高，不稀释就好了

2 回答325 围观

问PCR 结果

午后的红太狼

感觉是因为你提出来的RNA量太少的缘故，从你的内参的CT值可以看出来，可能你要检测的基因本来表达量就不高，内参的CT值不够低的时候，你的目的条带就扩不出来了，大概的看了一下，目的基因有值的那几个，基本都是内参测得比较低的几个，所以建议RNA多提一点，多逆一点，把内参的CT值降到20以下就差不多了

1 回答552 围观

问【求助】PCR 产物在加样孔里跑不出来怎么回事

xuyongbin

我也曾经遇到这种情况，后来把产物稀释100倍还有，最后我把产物稀释1000倍。取0.5ul，把退火在温度在原来基础上提高2℃就好了，可能是模板量太大的原因。

1 回答316 围观

问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

1 回答135 围观

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