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科研学霸天团,48小时有问必答
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怎么用primer premier来设计自己想要的引物
汤姆卜丽波
首先下载安装并激活Primer Premier 5 软件,打开软件,点击左上角,选择“File”→ “New” →“DNA Sequence”,然后复制参考模板DNA序列,在输入框内点击Ctrl+V键,将DNA序列粘贴进来:接着点击左上角“Primer”按钮,再点击“Search” 按钮,然后选择并输入一些参数,一般最上面点击“PCR Primer”,下面选择“Pairs”,然后输入上游(正义,S
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问
qpcr溶解曲线异常
Junego
1.看NTC的熔解曲线是不是和目的基因的峰值有差异,如果不同,说明是非特异性扩增。也可以将产物跑电泳看看条带是否大小不同。2.如果1中熔解曲线相同,可能有气溶胶污染。看一下Ct值差异,如果NTC和目的基因Ct值差10以上,可以分析一下相对表达量。
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为什么我的GAPDH cq值很齐但是microRNA的cq值确相差比较大?
天一湖医者
同时做2到3个housekeeping基因,是个比较好的方法。因为你这里的gapdh显然不太好。
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引物扩增以后出现各种多条带,内参条带正常,可能的原因
bamboopiggy
引物不特异,或者是因为annealing temperature过低,出现了非特异结合。还可能是逆转的效果不好。
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问
怎么确定pcr的退火温度,是参考值减5吗,如果两个引物退火值相差很大怎么办?
天一湖医者
1.退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8) 只是粗算,有时不灵,但比较简便。2.用primer5(or oligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认为这个值就是退火温度,我的经验再加2 or 3度最好。
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问
pcr扩增中出现的非特异性条带
Eason老歌迷
一般出现非特异性条带,我们可以用下面的办法解决,降低引物和聚合酶的用量,提高退火温度,或者是采用梯度PCR法,测试能够获得最佳结果的温度退火。如果还是不行,就试试touchdown方法,退火温度从高到低,每隔一个反应温度下降1C或者怎么样的,这样可以便于扩增出特异性更好的条带。当然,如果模板可以纯化一下,或者重新制备,也可以避免有非特异物质或者是降解的片段干扰。总之就是先优化。实在不行需要重新设计
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18T质粒测序结果比对不上
天一湖医者
1、测序结果比对时候,选用反向互补;如果依旧不对,2、可能是没连上去,因为PCR能扩出条带,不一定就是你目标条带,PCR不严格,不能完全说明问题。此种情况,建议,挑选多个单克隆,进行PCR,挑选最亮的且条带大小一致的送去测序。
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pcr扩增中用到的DNA聚合酶有哪几种,怎么选择用哪种?预混的好,还是自配的好
bamboopiggy
有做普通pcr的rTaq酶,也有做克隆的,高保真的LA taq酶等等好多,主要看你的实验目的是做genotyping还是做克隆,如果做克隆,根据你片段的长短,也可以选择不同的DNA聚合酶。至于要用预混的还是自配的,也是看你的实验目的,预混的方便,自配的,可以加入一些提高克隆效率的Mg2+或者DMSO,这一切都是根据实验目的。
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PCR技术如何应用于亲子鉴定?
Eason老歌迷
利用PCR技术合成的DNA进行亲自鉴定,其原理是:首先获取被测试者的DNA,并进行PCR扩增,取其中一样本DNA用限制性内切酶切成特定的小片段,放进凝胶内,用电泳推动DNA小片段分离,再使用特别的“探针”去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起,然后利用特别的染料在X光下,便会显示与DNA探针凝聚于一起的黑色条码,每个人的条码一半与其母亲的条码吻合,另一半与其父亲的条码吻合。
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同源重组构建质粒求助
天一湖医者
回收完跑胶测浓度了吗 ,错误一般是亮度太低浓度太低。
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有关pcr mapping分析基因环境结构的问题
Eason老歌迷
引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp。引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜。引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间。可以用ncbi查,然后用Primer Premier设计
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细菌质粒构建如何确保准确
天一湖医者
保存质粒用的菌宿主需要小心选择,因为有不少菌株已经工程化,有些缺失了某些纠错系统,有些则还保留着重组体系。典型的是最好不要用表达载体保存质粒,如BL21(DE3)就不适合,由于其没有缺失重组酶RecA。具体可以看各菌株的基因型。常用于保存质粒的菌株有DH5a, XL1-blue, TOP10等。
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问
跑PCR,遭遇没有目标引物序列出现
天一湖医者
你拿到的测序结果,是从引物开始后面30-50个碱基以后开始的序列,引物序列是看不到的。这个和测序机器的性能有关。一般从引物开始的一小段序列出峰会很不稳定,有稳定峰图可以读出序列一般都是20-30个碱基之后了。你手头若是有峰图结果你看看最开始那段的峰图就知道了。至于拿到的序列到底是什么,ncbi上blast一下不就什么都知道了
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问
WB没有目的条带,咋回事
天一湖医者
蛋白提取的不好;样品保存不当;处理条件不对;甚至有些WB操作问题等等
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质粒过表达1000多倍,这正常吗???
灵枢天问
正常的。如果本身表达够低,这种情况就很正常
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是否可以对入噬菌体直接进行LA PCR反应?
未来9
可以的,可以直接对菌体直接进行LA PCR反应
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问
对Mammalian cell或E. coli只进行热处理 98℃,2 min或Protease处理的样品可否进行LA PCR?
bamboopiggy
不太合适,因为模板这么处理不纯,LA pcr的结果会不好。
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问
使用LA Taq是否也产生A的Overhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?)
bamboopiggy
LA taq扩增得到的PCR产物的3’端常附有一个"A"碱 基,可直接克隆于T-Vector中
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问
如何在共有序列巢式PCR实验中减少假阳性?
天一湖医者
1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,
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问
PCR的循环数可以超过35吗?
未来9
一般不超过35次。随着反应时长加长,会导致非特异性产物相应增加产生干扰;另外设计实验的时候减少循环次数可以减少使用量缩短时间。
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