WB（蛋白免疫印迹）

蛋白质磷酸化属于蛋白质翻译后修饰，是细胞信号转导过程中常见的一种修饰方式，常常用来调节蛋白的活性、构象和相互作用等生物学功能。真核生物中常见的磷酸化发生于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸残基上。研究蛋白的磷酸化状态对于理解细胞生物学过程具有重要意义。检测蛋白质磷酸化水平的方法有蛋白质免疫印迹（Western blotting）ELISA 酶联免疫反应、细胞免疫化学（ICC）、流式细胞术和磷酸化抗体芯

Western 免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜

1、厚薄玻璃板须洁净，干燥，夹板架固定好玻璃板，注意不要漏液，注意两块玻璃板底部保持平齐；2、分离胶和积层胶溶液必须充分混匀，加入 AP、TEMED 后迅速轻摇混匀，灌入两块玻璃板间隙中；3、用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面，阻断空气，分隔线会更加平直，待分离胶凝聚后倾斜架子，用滤纸吸干剩余的无水乙醇；4、梳子垂直插入两块玻璃板中间，注意避免梳子孔之间产生气泡，室温水平放置，待积层胶凝聚，轻轻

（1）杂交信号很弱，条带浅，如下图原因及对策：1. 蛋白量太少，可以适当增加蛋白上样量；2. 抗体效价太低，可以适当加大抗体浓度；3. 过度漂洗膜，也可能会导致信号变弱、条带太浅；4. 转移到膜上的蛋白太少，当蛋白分子量 <10 KD 时，可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。（2）条带上有单个或多个白点原因及对策：「三明治」结构不紧凑导致，夹板做「三明治」结构时要确保膜和胶块

1、蛋白降解；对策：于冰上提取，buffer 里加蛋白酶抑制剂防止降解。2、样品保存不当；对策：提取后尽快测定浓度，并煮沸变性，未煮沸样品保存置于 -80 ℃ 保存。3、胶浓度较低，容易跑过头；对策：换用浓度较高的胶，例如 15% 或者用梯度胶。4、转膜时间太长，小分子蛋白转过头；对策：减少转膜时间，可尝试 200-250 mA 转 15-30 min 左右。5、膜孔径太大；对策：换用小孔径如 0

1、提取时冰上操作，buffer 添加蛋白酶抑制剂；2、蛋白尽量同一批次提取、测定浓度，保存及使用情况尽量一致，防止部分样品有降解；3、蛋白提取后尽快测定浓度，添加标曲；4、最好调整为统一浓度后上样体积保持一致；5、每孔上样体积不宜过大或过少，不超过最大上样量，避免样品溢散污染；6、由于样品有一定粘滞性，枪头吸液后外壁会黏附一些，加样时需注意，使用长而细的枪头；7、相比等体积上样，如果可以，尽可能

蛋白质泛素化是将泛素分子共价结合到靶蛋白上, 属于蛋白质翻译后修饰，整体流程是先用蛋白质免疫共沉淀技术(co-ip)，获取所需检测的蛋白质，再用泛素化抗体检测该蛋白质的泛素化水平。

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

寡聚化指单体化合物之间形成二、三、四聚体或长链分子（低聚物）。在生物背景下，寡聚化通常是指生物大分子（如蛋白质）通过非共价相互作用形成大分子复合物的过程。在生理或病理状态下，生物体内都会有寡聚化的现象。

免疫印迹法（Western Blot，WB）是一种通过识别蛋白质的特定抗原性进行检测和分析的方法，可用于抗体纯化。在免疫印迹法中，通过利用蛋白质的亲和性和特异性，将抗血清中的待纯化抗体与其所特异结合的抗原分离出来。

Western 印迹技术即蛋白质免疫印迹技术。

Western blotting 主要用于检测蛋白质，其技术流程分为蛋白质电泳分离、蛋白印迹（转膜）和免疫检测三个步骤。

这是一个建立在 Burnette 实验方案基础上的实验流程，小于 80k Da 的蛋白质的转移效果很好并且结果稳定, 重复性好。应用这种膜转移方法，我们利用多克隆抗体在下面的样本中检测目的蛋白：哺乳动物细胞和细菌溶解产物、细胞培养上清、组织提取物以及组织液。虽然下列实验条件是根据我们自己的实验需要已经得到优化的条件，但是在免疫印迹实验的其他应用中，这些实验条件也许还需要小的调整。

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot，通过特异性抗体与凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析其着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot 鉴定外泌体蛋白可以检测膜蛋白（如 CD63、CD81、CD82、HLA、integrin 等），检测膜结合蛋白或外泌体游离蛋白（前者如 ALIX、TSG101，后者如 HSP70、A

实验具体步骤详见下方配图，每一步都有图及文字说明。

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取：1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2. 每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3. 按 1 ml 裂解液加 1

1. 安装：（1）先找到图 1 所示的图标，双击安装。图 1 （2）系统重启后桌面出现图 2 所示的图标 图 2 2. 激活：在安装文件夹找到图 3 图 3 （1）双击后出现图 4 所示的对话框 图 4 （2）点击 Apply patch 后，打开桌面 Quantity One 图标，激活完成。3. 应用：（1）首先，随便打开一个 Western blot 结果图片（注意：图片格式为 TIF ）

蛋白来源：胰腺癌细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：16 KDa and 42 KDaWB用膜类型、孔径：PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压转膜时间：90 min转膜设备：湿转 Bio-Rad蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KDWB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两

问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Ma

蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 AnalyticalBiochemistry 中首次被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家，但印迹的对象是 DNA 链，他把这种技术称为 Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对 RNA，一个对蛋白质