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蛋白印迹

相关实验:免疫印迹(immunoblotting)

最新修订时间:

简介

Western blotting 主要用于检测蛋白质,其技术流程分为蛋白质电泳分离、蛋白印迹(转膜)和免疫检测三个步骤。

原理

蛋白印迹(Western blotting/protein blotting)用于分离和检测生物样本中的某一特定蛋白,其基本原理是通过凝胶电泳分离混合蛋白质样本,将其在特殊虹吸或电场装置印迹(blot)至固相介质上,即将凝胶与固相介质(滤膜)贴合,可使凝胶中已分离的各蛋白条带转移至固相介质的相应位置;而后根据抗原-抗体特异性结合的原理,将针对特定蛋白的特异性酶联抗体作用于滤膜,使目的蛋白与抗体特异性结合,最后利用偶联的酶降解底物生成有色沉淀物或产生化学发光产物,从而在滤膜上显示蛋白的存在及量。

用途

Western blotting 技术的应用非常广泛,由于可定性和定量检测目的蛋白,常用于疾病患者血清抗体的诊断、分型检测。

材料与仪器

试剂:
 
Towbin 印迹缓冲液(0.025mol/L Tris,0.052mol/L 甘氨酸,20% 甲醇,0.037% SDS),TBST 缓冲液(pH7.5 Tris-HCl-0.05% Tween20),脱脂奶粉,兔抗 TRIM22 多肽(MDFSVKVDIEKEVTC)-KLH 偶联蛋白多克隆抗体,HRP-山羊抗兔 IgG,鼠抗人 GAPDH 抗体,ECL SuperSignal West Fermto Maxium Sensitivity 试剂盒,显影液,定影液。
 
仪器:
 
转膜仪、硝酸纤维素膜(0.45 μm)、X 线感光胶片

步骤

蛋白印迹的基本过程可以分为以下几步:

 

(一)蛋白质电泳分离:

 

1.样本处理
蛋白质样本首先经过离心(4 ℃,15000 r/min 离心 30 分钟)除去不溶物,再经 SDS 上样缓冲液 100 ℃ 变性 3~5 分钟,使带有强负电荷的 SDS 与带有较弱电荷的蛋白质结合,大量 SDS 可掩盖蛋白质自身的电荷量,只显示 SDS 的负电荷,在 pH8.6~pH8.8 的 Tris-甘氨酸不连续 SDS-PAGE 系统中,蛋白质的泳动与自身电荷量无关,只和其分子大小有关,从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。
 
电泳样品中总蛋白质浓度不能超过凝胶系统的装载能力,可采用微型电泳系统时,每一个加样孔内的总蛋白量不能大于 5 μg,目的蛋白量在 10 ng 左右较好,蛋白量过高将出现拖尾或蛋白带融合现象。蛋白质样本如经过浓缩,须用合适缓冲液透析除盐后上样,否则在高盐状态下电泳将出现电泳带扭曲的现象。
 
2.凝胶选择
根据目的蛋白质分子大小选择合适的凝胶浓度,一般情况下,用于免疫印迹的 SDS-PAGE 凝胶浓度与所分离的蛋白质分子量间的关系如表 1 所示。为提高样本分辨率,通常采用高一级凝胶浓度的电泳系统,将获得更好的结果。
 
表 1 凝胶浓度与蛋白分子量的关系
凝胶浓度
分离蛋白质范围(MW)
8%
>50000
10%
30000~200000
12%
20000~150000
14%
10000~100000
17%
5000~100000
 
为使电泳后蛋白质从电泳凝胶中转移至固相支持膜上,还须考虑凝胶的浓度及厚度。凝胶的百分含量和交联度越低,转移越容易,最软的凝胶可产生最好的转移效率,但凝胶浓度过低可导致电泳带变宽、融合,降低分辨率。凝胶越薄,转移效率也就越高,但过薄的凝胶易碎,导致操作困难。多数情况下采用 0.5~1 mm 厚凝胶,为提高蛋白上样量和检测敏感度,可适当增加凝胶厚度,但不宜超过 2 mm。

 

3.蛋白质标准品选择蛋白质凝胶电泳需要蛋白质标准品(molecular weight marker)指示系统,来显示电泳的分离效率、转膜效率以及样本泳动情况。SDS-PAGE 凝胶电泳如采用普通蛋白质标准品,须经蛋白质染色后才能确认上述电泳参数,故问题发现不及时,常常导致无效的重复电泳。彩色标准品(rainbow marker)可弥补这一欠缺,如表 2 所示,该 Marker 在电泳凝胶中随蛋白质的迁移,各分子量条带逐渐分开,并显示多种色彩的条带,可直接肉眼观察泳动及分离情况,当目的分子量大小的 Marker 迁移到合适位置(距凝胶底部 1/3 处),同时其与相邻两条 Marker 达到足够分辨距离时,即可停止电泳,取出凝胶。蛋白质样本转膜后的转膜效率和目的蛋白质分子量,均可通过彩色标准品直接推算。
 

表 2 常用高分子量彩色标准品

标准蛋白质
分子量
颜色
myosin
200000
phosphorylase b
97400
BSA
00069
ovalbumin
46000
carbonic anhydrane
30000
trypsin inhibitor
21500
绿
lysozyme
14300
赤紫
 
 
4.SDS-PAGE
 
1)安装电泳装置和玻璃板。
 
2)配制分离胶:按照所需浓度和体积依次混合 H2O,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 过硫酸铵,最后加入 TEMED,立即快速混匀。
 
3)迅速在两玻璃板间隙灌入分离胶溶液,留出沉积胶所需体积和梳子齿长高度。小心地在胶上覆盖一层去离子 H2O,垂直放置于室温中,约 30 分钟使胶凝聚。
 
4)倒出分离胶上方覆盖液体,尽量吸干。
 
5)配制 5% 浓缩胶,依次混合 H20,30% 丙烯酰胺,1.5 mol/L Tris(pH8.8),10% SDS,10% 过硫酸铵,最后加入 TEMED,立即快速混匀。
 
6)在分离胶上方灌入浓缩胶,并插入梳子,避免气泡!再灌入适量浓缩胶填满梳子齿间缝隙,垂直放置于室温。
 
7)将蛋白样品加入等量 2X SDS 加样缓冲液,100 ℃ 加热 3 分钟使蛋白变性。2000 r/min,常温离心 3 分钟。
 
8)取出浓缩胶中梳子,以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。将凝胶装置固定于电泳装置中,在上、下槽均加满 Tris-Glysine 电泳缓冲液。
 
9)加样 10~20 μl。
 
10)将电泳装置通电,电压 8V/cm,当染料前沿进入分离胶后,电压提高到 15V/cm,电泳至溴酚蓝到达胶底部,约 2~4 小时。
 
11)关闭电源,取出玻璃板,撬开玻璃板,小心取出凝胶。

 

(二)蛋白质转膜:

 

1.半干式电印迹流程

 

1)Tris/甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后,取出凝胶,在 Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。

 

2)安装印迹装置:戴手套操作,将阳极(石墨电极板)平放,蒸馏水淋洗,阳极板上放 3 张印迹缓冲液浸透的 3 mm 厚滤纸,用玻棒或滚筒轻轻碾压去除气泡!将印迹缓冲液浸透的硝酸纤维素膜放在滤纸上,再将凝胶平放在硝酸纤维素膜上,最后在凝胶上面加盖 1~3 张印迹缓冲液浸透滤纸,撵出气泡。滤纸、硝酸纤维素膜大小必须与胶大小一致,并精确对齐,否则多余的边缘互相接触会导致短路。在滤膜和凝胶剪一角或以铅笔作标记。

 

3)在滤纸顶部压上阴极板,连接电极,根据凝胶的面积按 0.65 mA/c㎡(微型胶常用 1~2 mA/c㎡)接通电流(如 14 mm x 14 mm 凝胶电流<0.3 A),经 1~1.5 小时电转印,电流降至相对平稳(如 14 mm x 14 mm 凝胶电流降至 0.1 A)时,切断电源,取出膜放置在 20 mmol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液内,室温漂洗 10 分钟。凝胶可进一步采用考马斯亮蓝染色,观察蛋白残留量等。半干电转印装置如图所示。

 

2.湿式电印迹流程

 

1)戴手套安装印迹装置:剪 2~3 张与压板大小相仿的滤纸,浸湿转移缓冲液后,放于压板阴极端的海绵衬垫上方。将 SDS-PAGE 胶放于滤纸上方,注意始终保持湿润。将 PVDF 膜剪成相似大小,浸湿后放于胶上方。将 2~3 张滤纸放于硝酸纤维素膜上方。注意上述滤纸、胶、膜、滤纸叠加过程中,用玻棒或滚筒轻轻碾压,务必去除气泡!放上浸湿的海绵衬垫,夹紧夹板。

 

2)安装转移装置,放于槽中,注满转移缓冲液,将整个电泳槽放在盛满碎冰的大型塑料槽中,调整电流 0.3~0.5 A,电转印 1~3 小时。

 

3)关闭电源,取出硝酸纤维素膜,放置在 20 mmol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液内,室温漂洗 10 分钟。凝胶则可进一步采用考马斯亮蓝染色,观察蛋白残留量等。

 

(三)特异性抗体免疫检测:

 

1.抗体的选择用于免疫印迹的抗体有多克隆及单克隆抗体。免疫检测的成功与否和抗体识别抗原表位的特异性和效率相关,凝胶电泳常导致蛋白质抗原部分变性,所选抗体应满足对电泳后抗原表位的识别,单克隆抗体只能识别特定构象抗原表位,不易识别变性后表位,因此,免疫印迹常采用多克隆抗体。杂交背景与应用抗体的量相关,合适效价的抗体才能获得清晰的杂交背景和显著的目的条带。免疫印迹使用的抗体效价与间接 ELISA 法确定的抗体效价相当或高一个数量级。

 

2.封闭抗体作用之前,需对转印膜进行空白位点封闭防止免疫试剂的非特异性吸附。一般采用异源性蛋白质或去污剂,常用 5% 脱脂奶粉、0.5%~2% BSA,10% 血清(马/羊)和 0.2% Tween20 等。封闭液应与检测试剂相适应,如以葡萄球菌蛋白 A(SPA)为检测试剂,就不宜用全血清封闭;其次尽可能降低非特异背景。常用 5% 脱脂奶粉和 2% BSA 封闭。封闭基本流程如下:

 

1)取漂洗的转印膜,放入含 5% 脱脂奶粉的 0.05 mol/L pH7.5 Tris-HCl 封闭液内,在摇床上室温平缓摇动 1~2 小时,或 4 ℃ 过夜。

 

2)以 0.05 mol/L、pH7.5 Tris-HCl-0.05% Tween20 洗液,漂洗一次,5~10 分钟。

 

注意:封闭 PVDF 膜需要比硝酸纤维素膜更高的奶粉或 BSA 浓度。封闭后的胶可冷冻长期保存,使用时用过量封闭液漂洗 10 分钟,而后检测。

 

3.抗体特异结合主要采用间接免疫法,即先加入未标记特异性抗体(Ab1)与膜上蛋白结合,再加入标记酶、放射性同位素(如 1251)等的二抗(Ab2),最后以酶底物或放射自显影显色。

 

1)将封闭后的滤膜放入杂交袋中,加入抗体稀释液稀释的 1 ml Ab1(<10 cm x 8 cm 膜),封口机封口,4 ℃ 孵育过夜或室温摇动孵育 2~4 小时。

 

2)洗液洗膜 3 次,每次 5~10 分钟。

 

3)加入标记 Ab2,室温摇动孵育 2 小时。

 

4)洗膜 3~6 次,每次 5~10 分钟。

 

4.显色/显影

 

(1)辣根过氧化物酶 ECL 显色

 

1)取 Western blot 用 ECL 试剂 A 和 B,用前在暗室内将 A、B 液各 1 ml 等量混合,加 2 μl 30% H2O2

 

2)在暗室内将抗体作用后印迹膜放入显色盒,加混和显色液 2 ml,约 1 分钟,出现明显发光带。

 

3)将印迹膜移入暗盒内,用保鲜膜包好,上面铺一张 X 线感光胶片,大约曝光 30~60 秒,取出 X 线片,显影、定影,结果可永久保存。该步骤现已常常应用仪器直接读取发光条带,以图片形式直接反应结果,操作简便。

 

(2)辣根过氧化物酶-DAB 法

 

1)DAB 贮液配制:10 ml pH7.6 50 mmol/L 的 Tris-HCI 缓冲液溶解 6 mg DAB。临用前加入 5 μl 30% 的 H2O2

 

2)加入增强金属离子的二氨基联苯胺(OPD)底物液配制:在 9 ml 的 50 mmol/L pH7.6 Tris-HCl 缓冲液中溶解 6 mg OPD,加入 1 ml 0.3% NiCl2 或 CoCl2(w/vol),形成少量沉淀,取上清用于显色。

 

3)显色:Ab2 作用后印迹膜放入 DAB 显色液中,室温 1~5 分钟,可见明显棕褐色显色带。以 OPD 显色呈黑色。

 

4)终止:用 Tris-HCl 缓冲液漂洗即可终止。立即拍照或扫描记录,经日照会褪色。

 

(3)碱性磷酸酶(AP)法

 

1)5-溴-4-氯-3 吲哚-磷酸盐四氮唑蓝(BCIP/NBT)贮液配制:NBT,10 ml 70% 的乙醇中溶解 0.5 g NBT。BCIP,10 ml 100% 二甲基甲酰胺中溶解 0.5 g BCIP。贮存液 4 ℃ 保存,稳定保存一年。

 

2)AP 液:0.1 mol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,0.1 mol/L Tris-HCl(pH9.5)。

 

3)底物显色液:取 66 μl NBT 贮液与 33 μl BCIP 加入到 10 ml AP 缓冲液中,充分混匀,临用前 1 小时内配制。

 

4)显色:Ab2 作用后印迹膜放入 AP-BCIP/NBT 显色液,室温下 1~5 分钟,现蓝色显色带,背景极浅时约需 30 分钟。

 

5)终止:用 20 mmol/L EDTA(pH8.0)的 Tris 缓冲液漂洗,终止反应。

注意事项

1)甲醇可增强蛋白与膜的结合效率,但是降低大蛋白的结合效率。对于非 SDS 胶或等电聚焦胶可不用甲醇。使用高质量分析纯的甲醇,否则将增加缓冲液导电率影响转移。SDS 影响蛋白转移到硝酸纤维素膜的效率,因此缓冲液中含 SDS 时建议使用 PVDF 膜。
 
 
2)采用 PVDF 膜时,必须先经甲醇激活后才能使用,最好将 PVDF 膜放置在少量甲醇中浸透 1 分钟,再用电转印液漂洗 5 分钟,最后浸在电转印液中约 30 分钟,即可用于转膜。如果不经电转印液充分浸透,甲醇激活后立即应用常常因膜非特异性吸附不均匀,出现点状染色污染的背景现象。
 
 
3)接触硝酸纤维素膜、胶和滤纸时,必须戴手套,防止手指来源蛋白的污染。
 
 
4)在胶以及硝酸纤维素膜的左上角或右上角剪一角作为方向标记。
 
 
5)常规的 29:1 配制的凝胶,不易判断浓缩胶凝聚情况,上样时泳道较难分辨,微型胶上样时更困难。本方法制备的浓缩胶完全凝固后呈近似乳白状,易分辨,且浓缩效果也较好。
 
 
6)槽式转移时,若整个印迹装置没有夹紧,则蛋白将放射状地从胶上转移,导致拖带。
 
 
7)不建议用过低电流;但是电流过高使加热不均匀,导致转移条带扭曲。最佳转移电压取决于丙烯酰胺胶浓度、胶厚度、胶的缓冲系统以及蛋白的分子量和形状。
 
 
8)转移时间过长,则蛋白可能会移出硝酸纤维素膜;蛋白从 SDS 胶中移出较快,但从非 SDS 胶中移出较慢。
 
 
9)电转印(半干/湿式)可将 50%~70% 的蛋白从凝胶中转印至膜上,如果转印效率过高,不仅影响剩余凝胶的蛋白质染色,也可导致在高电流长时间作用下,蛋白质从膜上进一步向滤纸中转移,致使膜上结合蛋白质的实际含量下降。
 
 
10)湿式转印如果采用低电流转印,转印效率较低,而且时间长。大电流转印时,常常导致电泳液过热现象。因此,电泳应在具有冷却水循环电泳槽或冰浴内进行。
 
 
11)免疫印迹检测的敏感性取决于蛋白上样量与免疫检测系统的敏感度,酶免疫方法通常可检出 20 fmol 的蛋白,即分子量为 50000 的蛋白 1ng。因此凝胶电泳时蛋白上样量应保证被测蛋白量不低于 1ng,如过低应纯化和浓缩后再行免疫印迹检测。

来源:丁香实验

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