蛋白印迹常见问题指南
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根据问题的类型主要分成以下几类: 1. 谨言 以下资料权作参考,请勿盲目模仿 2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?
C. 细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot?
D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗,这样对Western Blot有无影响?
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
G. 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?
I. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
J. 蛋白变性后可以存放多久?
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?
L. 接下来我准备采用DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?
M. 还有一问题,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?
N. 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点? |