实验技巧：SDS－PAGE 电泳常见问题及指南

Q：SDS－PAGE 电泳的基本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4 g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？

A：在 SDS－PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris－HCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7，分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？

A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。

1、还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT（或 Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5 min，再离心加样。

2、带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20％ 的碘乙酸胺，并在室温保温 30 min。

3、非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1％SDS 沸水中煮 3 min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

Q：SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？

A: 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 tris－HCL 系统，具体作用后面介绍；
TEMED 与 AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；

十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q：提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？

A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q：「微笑」（两边翘起中间凹下）形带原因？

A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

Q：「皱眉」（两边向下中间鼓起）形带原因？

A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

Q：为什么带出现拖尾现象？

A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

Q：为什么带出现纹理现象？

A：主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

Q：什么是「鬼带」，如何处理?

A：「鬼带」就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？

A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7）；适当降低电压；

Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

A：这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a. 内外槽装反；b. 外槽液过少；c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。

Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。