蛋白质的 SDS-PAGE 电泳

试剂：

过硫酸铵、含 2-巯基乙醇的样品缓冲液、样品缓冲液 （2X） 储液

电泳缓冲液、电极缓冲液、压缩胶缓冲液、分离胶缓冲液

1、装置的清洗

为使角蛋白的污染减至最少，将玻板、梳子和隔条浸泡在含强碱性去垢剂（2% RBS 35 液）提浓物的水溶液（每 1000 mL 水加 20 mL 提浓物）。可将去垢剂溶液置于一带盖的盆中，盆中放一支架，将玻板悬置于支架上至少保持 10 min（或过夜）。

此外，努力保持凝胶材料和溶液尽可能是无尘的。有时要用缓冲液对吸管进行预冲洗，以除去可能沉积于吸管内的灰尘颗粒。操作时要一直戴手套并经常变动它们的位置。用不会留下颗粒的纸巾（如 Kimwipes 纸巾）擦干玻板，或用甲醇或丙酮洗涤玻板并在通风橱中风干。分离胶的混合在对待测蛋白质的大小所作最佳估计的基础上，选择合适的丙烯酰胺浓度。

2、分离胶的灌注

(1) 将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H₂O、4x 分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号（25 mL）爱伦美氏烧瓶。

(2) 用塞塞住瓶口，混合物真空脱气 10 min。

(3) 加 APS, 温和但彻底混匀。尽量避免产生气泡。

(4) 加 TEMED。温和但迅速混匀。

(5) 用经水预洗净的巴氏吸管灌注胶液，直至液面高度离玻板顶部约 1 cm 处。

(6) 用预洗净的巴氏吸管在胶液上面均匀布一层异丁醇（2-甲基-1-丙醇）。异丁醇层应高约 2 mm。

(7) 分离胶至少聚合 1 h。

3、压缩胶的灌注

(1) 将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H₂O、4x 分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号（25 mL） 爱伦美氏烧瓶。

(2) 用塞塞住瓶口，混合物真空下脱气 10 min。

(3) 分离胶聚合后，倾出上层液体异丁醇和未聚合的丙烯酰胺。

(4) 用蒸馏、去离子水洗涤胶的上部。

(5) 用压缩胶液洗涤胶的上部。

(6) 将梳子插入玻板之间。

(7) 加 APS, 温和但彻底混匀。努力避免产生气泡。

(8) 加 TEMED。温和但迅速混匀。

(9) 用预先经水洗净的巴氏吸管灌注压缩胶液。压缩胶应在 10 mm 内聚合。在 2 h 内使用。

4、电泳样品的制备

(1) 将沉淀或冻干的各样品分别置于 1.5 mL 具盖聚丙烯离心管中，各加入 5~20 uL 含 2-巯基乙醇的 1X 样品缓冲液。短暂震荡混合后立即置于沸水浴中支架上 5 min。

(2) 样品冷却至室温，微型离心机短暂离心（-10 s）。

5、加样

(1) 小心地取出梳子，将聚合的凝胶安置于电泳槽中。上、下槽中加入电泳缓冲液（1X），确保每个样品孔中都充满缓冲液。小心地去除样品孔中的所有气泡或额外的聚丙烯酰胺碎片。

(2) 每个样品按合适的体积加样，对于 0.15 cm 厚的胶，通常最多加 15 uL 样品。因样品含 10% 甘油，样品会通过样品孔中的缓冲液而沉入孔底。

(3) 当心样品不要溢出至样品孔间的分隔部而混合。用自动移液器上样应用出口极细的吸头，每个样品换一个吸头。

6、电泳

(1) 将电极导线接至电源，黑的接于负极，红的接于正极，pH 8.3 时，与 SDS 结合的蛋白质荷负电，它们将向正极迁移。

(2) 压缩胶部分每块胶以 8 mA 电流（恒流） 电泳。若两块胶在一个电泳槽内同时进行电泳，则以 16 mA 电流进行电泳。在压缩胶/分离胶界面处，蛋白质样品将压缩成一窄带。

(3) 当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流增至 18 mA。

(4) 溴酚蓝达到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。不应让溴酚蓝跑出底部。

7、溶液和缓冲液的配制

(1) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）：30%（w/v）丙烯酰胺 300 g与0.8%（w/v）双丙烯酰胺 8 g，加去离子蒸馏水至终体积 1000 mL。经 0.22 μm 膜过滤。存于 4 ℃ 暗处。

(2) 分离胶缓冲液（4x）：1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）与 0.4%（w/v）SDS，加去离子蒸馏水至所需终体积。室温下用 HCl 调 pH 至 8.8。经 0.22 μm 膜过滤。存于 4 ℃。

(3) 压缩胶缓冲液（4X）：0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）与 0.4%（w/v）SDS，加去离子蒸馏水至所需终体积。室温下用 HCl 调 pH 至 6.8。经 0.22 μm 膜过滤。存于 4 ℃。

(4) 电极缓冲液（4X）：0.1 mol/L Tris 与 0.768 mol/L 甘氨酸，加去离子蒸馏水至所需终体积。不必调 pH。此比例时 Tris 碱-甘氨酸的 pH 应为 8.3。室温下存于大容器（酸坛）中。

(5) SDS（10%；w/v）：取 10 g SDS 溶于去离子蒸馏水中，至终体积 100 mL。室温下存于洁净瓶中。

(6) 电泳缓冲液（1X）：1/4 体积的 4x 电极缓冲液与 3/4 体积的去离子蒸馏水混合。然后加 1/100 体积的 10% SDS 至终浓度 0.1%（w/v）SDS。

(7) 样品缓冲液（2X）储液：0.25 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）与 4%（w/v）SDS、20%（v/v）甘油痕量溴酚蓝配制此缓冲液，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白） 对缓冲液的污染。加 H₂O 至 100 mL 终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保 SDS 于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。

(8) 含 2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X）：用前配制样品缓冲液的工作液，稀释 2X 样品缓冲液储液，加入 2-巯基乙醇至终浓度为 5%（v/v）。

(9) 过硫酸铵 （APS）（10%；W/V）：取 3 g 过硫酸铵，溶于去离子蒸馏水，至终体积为 30 mL。此溶液 4 ℃ 下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。