简介
DNA 印迹（Southern blotting）技术用于检测基因组中的某一特定 DNA 片段，在阐明免疫基本原理中抗体（免疫球蛋白）以及 T 细胞抗原受体（TCR）的多样性中发挥了至关重要的作用。
原理
DNA 印迹的基本原理是首先由限制性内切酶作用于染色体基因组，获得若干大小不一 DNA 片段，通过琼脂糖凝胶电泳各 DNA 片段根据大小不同得以分离。在印迹装置中，DNA 在碱性缓冲液中变性为单链 DNA（ssDNA），在琼脂糖凝胶上方覆盖一层硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，DNA 由于毛细效应随缓冲液向上到达滤膜，则将 DNA 条带转移到滤膜上。随后以放射标记的目的基因特异性 DNA 探针与滤膜孵育，最后通过放射自显影法使目的 DNA 条带显示在胶片上。随着免疫学技术的进步，也可采用酶标抗体法检测探针中标记的地高辛，利用酶作用于底物显色，进而反映目的 DNA。Southern blotting 在阐明免疫球蛋白和 T 细胞抗原受体（TCR）的多样性中发挥了至关重要的作用。
用途
DNA 印迹技术常用于检测基因组中的某一特定 DNA 片段，在阐明免疫基本原理中抗体（免疫球蛋白）以及 T 细胞抗原受体（TCR）的多样性中发挥了至关重要的作用。
材料与仪器
试剂：
（1）限制性核酸内切酶、抗地高辛抗体-碱性磷酸酶。
（2）琼脂糖、硝酸纤维素膜或尼龙膜。
（3）变性液：1.5 mol/L NaCl；0.5 mol/L NaOH。
（4）中和液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）；1.5 mol/L NaCl。
（5）转移液（20 x SSC）：3 mol/L NaCl；0.3 mol/L 枸橼酸钠，pH7.0。
（6）标记探针。
（7）2 x 洗液：2 x SSC，0.1% SDS。
（8）1 x 缓冲洗液：0.1 mol/L 马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH7.5，0.3% Tween20。
（9）1 x 封闭液：1%（W/V）封阻剂溶于 1 x 马来酸溶液（0.1 mol/L 马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH7.5）。
（10）1 x 检测液：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，pH9.5。
仪器：
电泳仪、尼龙膜、摇床等。
步骤
DNA 印迹的基本过程可以分为以下几步：
1．DNA 片段电泳分离待测 DNA 样品，以限制性内切酶酶切，再经琼脂糖凝胶电泳分离。可先以溴化乙啶（EB）观察 DNA 条带位置，在凝胶旁置 1 标尺照相。切除无用部分，并于凝胶的左下角切除作标记。将凝胶浸泡于碱性液内室温 1 小时使之变性；对于较大的 DNA 片段（大于 15 kb），可在变性前用 0.2 mol/L HCI 预处理 10 分钟使其脱嘌呤后，再进行碱变性处理。将凝胶用去离子水漂洗 1 次，然后浸泡于适量的中和液中 30 分钟，2 次。而后安放印迹装置。
2．DNA 印迹毛细管转移印迹装置：在转印槽中，倒入 20 x SSC 溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置人：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印槽中（简称「桥」），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大），滤纸（与凝胶等大），吸水纸（略小于滤纸，5～8 cm 高），上压 400～800 g 重物。凝胶四周用 Parafilm 膜包围防止短路。滤膜事先用 10 x SSC 浸湿至少 5 分钟。滤纸事先用 20 x SSC 浸湿。转膜 8～18 小时，使凝胶中的 DNA 转移到上方的滤膜上。取出滤膜于 2 x SSC 摇洗 5 分钟，滤纸吸干。置 80 ℃ 真空烤箱烘烤 2 小时固定 DNA。对于较大 DNA 片段，紫外交联每面 3 分钟提高转膜效率。
3．DNA 印迹的免疫检测
（1）预杂交和杂交
1）将膜浸湿于 6 x SSC2 分钟，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度。
2）杂交膜封于杂交袋，按 0.2 ml/c㎡ 膜面积加入预杂交液，65 ℃ 预杂交约 3 小时。
3）用于 Southern blot 的探针常用 DNA 探针和寡核苷酸探针。探针标记又可分为放射性标记和非放射性标记，非放射性常用高辛标记探针。杂交时各种探针的用量：DNA 探针，5～25 ng/ml；寡核苷酸探针，0.1～10 pmol/ml。双链 DNA 探针提前在杂交缓冲液中 100 ℃ 变性 10 min 后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同；注意：应用寡核苷酸探针时，杂交温度 Tm ＝ 4 x（G ＋ C）＋ 2 x（A ＋ T），杂交温度比 Tm 低约 10 ℃。
4）弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少 3.5 ml/10 c㎡，65 ℃ 水浴杂交过夜或置入杂交炉滚动过夜。
（2）封闭：杂交后膜以 2 x SSC 洗液洗 2 x 15 分钟；0.5 x SSC 洗 2 x 15 分钟；而后以 1 x 缓冲液洗 3 分钟。加入 1 x 封闭液摇动孵育 60 分钟。
（3）抗体检测：加入封闭液稀释的碱性磷酸酶（AP）标记的抗地高辛抗体（若用显色法抗体稀释 5000 倍；若用 CSPD 发光法稀释 10000 倍；CDP-Star 发光法稀释 20000 倍），室温摇动 30 分钟。而后以 1 x 缓冲液洗膜 2 x 15 分钟。以 1 x 检测液平衡膜 1 x 5 分钟。
（4）底物显色
1）AP 的底物有两种，NBT/BCIP 显色底物和发光底物（CSPD 和 CDP-Star）。CSPD（disodium3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo［3.3.1.13,7］decan｝-4-yl）phenylphosphate）是一种灵敏的化学发光底物，CDP-Star 是其改进产品，发光速度更快（10 倍于 CSPD）且更强。底物液 CSPD 或 CDP-Star 用 1x 检测液稀释 100 倍，将膜浸于底物液室温避光静置 5 分钟；回收剩余的 CSPD 液或 CDP-Star 液避光保存于 4 ℃ 可反复应用 3～5 次。
2）以纤维纸挤去膜上多余液体，用杂交袋封好于 37 ℃ 预激活 15 分钟（用 CDP-Star 则无需），然后将膜固定于压片夹，进行曝光。
3）若用显色法，新鲜配制显色剂（45 μl NBT 和 35 μl BCIP 溶于 10 ml 1 x 检测液），将膜浸于显色剂中避光反应 4～16 小时，终止晾干即可。
注意事项
应用化学发光底物只能使用尼龙膜。
来源：丁香实验
