🔥 菌落免疫印迹法

菌落免疫印迹法是通过抗体与目标抗原（通常是细菌的表面抗原）结合的免疫化学反应，形成可见的免疫印迹，来检测和鉴定目的抗原。

用于快速检测和鉴定微生物菌落的种类和数量，以及判断微生物的毒力和抗原性。

细菌培养液，玻片，PVDF 膜或 nitrocellulose 膜，BSA，TBST，免疫血清，标记抗体，显微镜，培养平板，蛋白浓度测定试剂，离心管等。

菌落免疫印迹法检测目标抗原的步骤如下：

1、菌落培养：在含有适宜营养物质的琼脂平板上，接种要检测的菌株，并在适当的温度和时间下培养到菌落形成。将待分析的细菌菌株在培养基上培养至对数期阶段，培养条件为 37 ℃ 培养 12~16 小时。

2、取得细菌菌落：用悬针或小枪头从培养基上捞取单个菌落，涂抹在微型培养基（直径 90 mm）上。继续培养至菌落变大直径约 5 mm。

3、菌落裂解：加入 50 μl 的菌落裂解液（例如含有蛋白酶和 EDTA 的 Tris 缓冲液），裂解菌落，使其释放出细胞内蛋白质。

4、蛋白质定量：用比色法或其他方法测量裂解液中的蛋白质浓度，通常使用 BCA 测蛋白浓度试剂盒。

5、SDS-PAGE 电泳：

根据蛋白质大小，将菌落裂解液中的蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳分离。将分离后的蛋白质转移到 PVDF 或 nitrocellulose 膜上。

6、膜上免疫印迹：将膜浸泡在 5% 的非脂奶粉或 3% 的 BSA 的 TBST 缓冲液中，以防止非特异性结合。然后用特异性抗体与目标蛋白质进行孵育，4 ℃ 孵育过夜或室温孵育 2 小时。孵育后，回收抗体，含有目标蛋白的膜用 TBST 洗涤 3 次，每次 8 分钟。

7、检测：用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶标记的二抗与特异性抗体结合，结合条件为室温水平摇床孵育 2 小时。孵育结束后，用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 8 分钟。通过化学荧光或染色法检测信号，比较不同条件下的目标蛋白的表达。

1）菌落培养过程种注意无菌操作；

2）免疫反应的温度和时间要恰当；

3）各种液体的比例要恰当，避免视觉干扰；

4）标准菌株和阳性对照应同时设置。