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大分子量蛋白(470kDa)如何快速转膜?

相关实验:免疫印迹(immunoblotting)

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Zn_k4pf

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6 个回答

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staywalking

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Tris- Acetate gel电泳,低浓度甲醇冰水浴湿转。欲速则不达。

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whilt-shirt

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可以考虑选择快速转膜液,高电流转膜

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府宅

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因为多数大分子蛋白是膜蛋白,表达较少,建议适当增加上样量,并延长一抗孵育时间。

大分子蛋白与PVDF膜的结合不是很牢固,容易脱落,洗膜时要操作轻柔,不要过于粗暴,否则抗原抗体复合物容易脱落。

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dxy_gwrp7ndq

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恒压40V电压,转膜60-90min,一般小于400KDa的蛋白都能转到PVDF膜上。恒流法转,电流大小设置为PVDF膜的面积,转1小时左右即可,若怕转膜过头,可以将两张PVDF膜重叠起来。建议转膜后,使用丽春红染液染膜(Invent Cat# WA-004),检验转膜效率,蛋白条带分布和上样量如何,如果染色后无条带,则需考虑样品问题及转膜问题,进行调整。

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dxyv9281

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不同分子量的蛋白质选择的凝胶浓度和转膜时间也是不同的,原则上高分子量蛋白用低浓度胶,转膜时间较长,而低分子量蛋白用高浓度胶分离,采用较短的转膜时间

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菲菲飞呀飞

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提蛋白时应加入RIPA强效裂解液,在4℃环境下静置的时间延长十分钟到二十分钟。这样可以充分裂解大分子蛋白。

转膜时,湿转法与半干转法均可以(湿转法获得条带漂亮。半干转转膜效率高),转膜时,要保留分离胶。

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