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电泳、转膜

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转膜是把DNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物(一般是尼龙膜)上固定,是进行各种后续研究(如RFLP分析,阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究)的前提。

实验目的:

掌握Southern blotting的原理及操作步骤。

实验原理:

1. 转膜的方式:

  向上的毛细管转移

  向下的毛细管转移

  同时向两张膜转移

  电转移

  真空转移

2. 固相支持物的种类及选择:

  硝酸纤维素膜:非共价结合,易脆,易丢失DNA,< 500 bp的DNA无效,转膜前的工作(从提高转膜效率,利于转膜后使用等)。

  尼龙膜(带正电荷的):高强度,不易破损,具有较大的DNA结合容量,它能够吸附变性DNA,核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能,无论用哪边均可以经久耐用,可反复利用10次以上(10-20次),经毛细管(毛细吸附)作用,把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型,在80-100℃真空干燥2-4hrs,即可固定DNA。

3. 转移缓冲液(transfer buffer)的选择:

  带正电荷的尼龙膜:可用高盐离子强度(SSC),但不能充分发挥膜潜能;0.4N NaOH,共价结合DNA是最大优点。

  硝酸纤维膜:高盐离子强度促进DNA与膜结合(20×SSC),低盐离子强度导致小片段DNA在转移过程中丢失,pH>9,DNA不能与膜结合。

4.转膜时间(duration of transfe)约12 hrs

  取决于毛细管系统,DNA大小,胶厚度(<5mm)及浓度(<1%)。DN分子量A大小决定时间长短,部分去嘌呤减小DNA,碱转移2hrs大部分结合到膜。DNA转移的效率较难判断,只有在转膜结束后,通过EB染色及分子杂交才可以鉴别效率高低,但已无补救措施,因此,每一步应严格操作。

实验材料及试剂:

酶消化好的DNA样品,尼龙膜,0.2N HCl,0.4N NaOH等。

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