电泳及转膜技术
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实验概要
掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤
实验原理
1．转膜的方式：
向上的毛细管转移
向下的毛细管转移
同时向两张膜转移
电转移
真空转移
2．固相支持物的种类及选择：
硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）
尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的 DNA 结合容量，它能够吸附变性 DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附 DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把 DNA 从凝胶上转到膜上。 DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。
3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：
带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合 DNA 是最大优点。
硝酸纤维膜：高盐离子强度促进 DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段 DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ， DNA 不能与膜结合。
4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs
取决于毛细管系统， DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。
DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小 DNA ，碱转移 2hrs 大部分结合到膜。
DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。
主要 试剂
0.4N NaOH
0.2NHCl
琼脂糖
主要设备
尼龙膜
滤纸
玻板
电泳槽
实验材料
酶消化好的 DNA 样品
掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤
实验原理
1．转膜的方式：
向上的毛细管转移
向下的毛细管转移
同时向两张膜转移
电转移
真空转移
2．固相支持物的种类及选择：
硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）
尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的 DNA 结合容量，它能够吸附变性 DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附 DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把 DNA 从凝胶上转到膜上。 DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。
3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：
带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合 DNA 是最大优点。
硝酸纤维膜：高盐离子强度促进 DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段 DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ， DNA 不能与膜结合。
4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs
取决于毛细管系统， DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。
DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小 DNA ，碱转移 2hrs 大部分结合到膜。
DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。
主要 试剂
0.4N NaOH
0.2NHCl
琼脂糖
主要设备
尼龙膜
滤纸
玻板
电泳槽
实验材料
酶消化好的 DNA 样品
