🔥 蛋白印迹法检测蛋白质寡聚化

寡聚化指单体化合物之间形成二、三、四聚体或长链分子（低聚物）。在生物背景下，寡聚化通常是指生物大分子（如蛋白质）通过非共价相互作用形成大分子复合物的过程。在生理或病理状态下，生物体内都会有寡聚化的现象。

蛋白质印迹法是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质-蛋白质相互作用的一种技术，再通过蛋白质印迹法就可以检测蛋白质的寡聚化。

材料：

6 孔板、移液枪、1.5 mL EP 管

超声波细胞破碎仪，电泳转膜设备 PBS

蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂

SDS 上样缓冲液

TBST 电泳缓冲液：称取 SDS 10 g，Glycine 30.25 g，Tris-base 144.25 g，用 ddH₂O 定容至 10 L

转膜液：称取 Glycine 144 g，Tris-base 30.2 g，用 ddH₂O 定容至 10 L

1. 将实验所需要的细胞（一般为 1×10⁶ 个）接种至 10 cm 的细胞培养皿，约 12 h 后用 的磷酸钙转染法将目的质粒转染至细胞，等到 18～24 h 过后收集细胞。用 4 °C 的 1～2 mL PBS/皿洗涤细胞，离心，3000 rpm，3 mins，吸掉 PBS。

2. 将相应体积蛋白酶抑制剂加入到蛋白裂解液后，每皿加入 1 mL，置于冰上或者冰箱里裂解 10~15 min，收集裂解液至1.5 mL EP 管中，注意避免产生泡沫。

3. 将裂解液转移至超声波细胞破碎仪，功率设定 10%（实际功率为 96 w），超声 3 s，暂停 7 s，执行 5 次。当样品较浓时，超声完后，在液氮里面冻融 3 次。将超声后的样品与 4 °C 下离心 10 min，转速 12000 rpm。

4. 离心好后，将上清分为三部分，50 mL 作为 lysate，450 mL 实验组。Lysate 直接加 6× SDS 10 μL上样缓冲液，95 °C 加热 10 min。

5. 对照组加入1.5 mL相应的抗体，于 4 °C 旋转摇床中旋转 2h~4h（根据蛋白具体性质而定），如果信号弱，延长至过夜。

6. 加入35 mL protein G，于 4 °C 旋转摇床中旋转 1 h。

7. 利用含有 0.5 M NaCl 的 prelysis buffer 作为 wash buffer，其中 NaCl 为新鲜加入。将旋转摇床上的样品取下后，10000 rpm，30 s 离心样品，用真空泵吸去上清，在沉淀中加入 1 mL wash buffer，颠倒混匀，离心后吸去上清，此操作重复三至四次。利用微量进样器将 EP 管内残余的 wash buffer 吸干，加入 50 mL 1× SDS 上样缓冲液，瞬时离心，确保管底的 protein G 充分浸润在上样缓冲液中，在干式恒温器上 95 °C 加热变性 10 min。

8. 之后每个电泳槽使用 500 mL 左右 1× 上述电泳缓冲液进行电泳，70 V 电压下通电 15～20 min 后，将电压调至 130 V，90～120 min 后，关掉电泳仪，取下胶板。

9. 转膜，配置好 1× 上述转膜液，将 PVDF 膜在甲醇里激活 10～15 s 后泡在转膜液里备用，将取下的胶板也放在转膜液里浸泡 3～5 min。将滤纸、胶、膜依次贴好后，每个转膜槽使用 700 mL 上述转膜液，以 200 mA，120 min 转膜。

10. 将转印好的 PVDF 膜用 5% 的脱脂牛奶室温封闭 1 h 后，将牛奶洗掉，敷上相应的一抗。

11. 一般在室温孵育 1 h 或 4 °C 孵过夜后 （信号较弱的内源性抗体一般 4 °C 过夜），用含有 0.1% 吐温 -20 的 TBS 溶液洗膜三～四次，每次 10～15 min（一般根据抗体的性质决定）；再加入相对应的连接有辣根过氧化物酶（HRP）的二抗（使用 2% 脱脂奶配置），室温孵育 1～4 h 或者 4 °C 冰箱中孵育 8 h（根据蛋白性质决定）。

12. 再用 TBST 溶液洗膜，方法同上。使用不同强度的 ECL 化学发光检测溶液检测目的条带。

13. 根据蛋白印迹条带分子量大小，确定蛋白质是否寡聚化。如分子量 4 倍的地方有条带，设好各种对照，即可以判断出那是不是目的蛋白的四聚体形式。