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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
为什么western的内参调齐了一次之后,再按齐的上样量跑actin又不齐了
yanlai000
确定上样量一致,转膜条件一致,换配胶方式有可能会有这种情况
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问
WB条带问题分析
Eason老歌迷
可能是你的样品问题,比如说你没有在冰上裂解,蛋白降解了。也可能是你的胶切错了,把目的条带切掉了。一抗二抗混了,没有孵育好。
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问
蛋白质拓扑结构示意图绘制
bamboopiggy
这个可以用AI,自己画,如果你已经知道你的蛋白的结构的话
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问
角蛋白10和细胞角蛋白10
Eason老歌迷
是的,细胞角蛋白10是分子量56.5KD的①型细胞角蛋白。
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问
WB出现奇怪的线性条带
麻黄连翘赤小豆
多克隆抗体也可能这样,特异性较差
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问
Wb‖条带粗怎么办?
whilt-shirt
有可能是上样量过高,建议减少上样量试试
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问
求助:用了新的蛋白上样缓冲液后,SDS没有条带
冷泉港蛋白
需要知道上样缓冲液各组分及其浓度和特点,undefined上样含有4 %的sds,四度会结晶,需要恢复室温并混匀后使用。你加的上样缓冲液估计不含或含有很少的sds,不足以解离细胞或提供蛋白前进所需要的负电荷了。
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问
求助|flag-beads是自带抗性吗?
bamboopiggy
对,flag-beads是自带flag抗体的beads,你只要binding完了,煮了以后,要先用flag的一抗去杂,加二抗显影就可以。
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问
HIF-1α蛋白纯化!!!
Eason老歌迷
做过,可以做出来。但是吧,GST融合蛋白容易氧化形成二聚体,影响纯化效果,所以经常会在结合及洗脱缓冲液中添加1-10mM DTT,效果才会好。
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问
低丰度蛋白跑western blot
whilt-shirt
增加上样量至10-20ul,一抗稀释比例提高到1:500试试
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问
小鼠血清能用PBS稀释吗?
whilt-shirt
PBS是等渗溶液,理论上是可以的
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问
WB.结果分析
whilt-shirt
应该是数据之间差异比较大,建议调整曝光时间使条带颜色差不多试试
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问
融合蛋白结构域连接可以嘛?
bamboopiggy
还是要用linker的,直接融合会影响蛋白的折叠
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问
最近在做毕赤酵母蛋白诱导,总是失败?
Eason老歌迷
可能是有几个原因。如果用GS115表达不出蛋白,我们换成KM71H后,大部分克隆能表达。 我们尝试过在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低。ph的话就选择用6.0——6.8,BMMY的pH7.0-7.5比较合适。
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问
蛋白纯化时发现沉淀出现问题?
Eason老歌迷
硫酸铵沉淀是很粗的分级方法,建议你精纯的话还是要过柱子的。
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问
原核诱导蛋白,相关问题求助?
Eason老歌迷
诱导的蛋白只在沉淀中,上清中没有,这个现象很正常,我也遇到过。你可以提前去biotech上查看预测蛋白可溶性问题。在或者看你的外源蛋白是否含有稀有密码子,如果有的话建议使用Rosetta表达菌株。
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问
蛋白在纯化时,如何定量?
Eason老歌迷
蛋白质含量方法常见的有以下四种。根据物理性质:紫外分光光度法。据化学性质:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowry法)、BCA法、胶体金法。根据染色性质:考马斯亮蓝染色法、银染法。根据其他性质:荧光法。我们实验室更喜欢用考马斯亮蓝染色法。
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问
有人知道做体外蛋白修饰抗体法验证时,考马斯亮蓝染色的作用?
Eason老歌迷
做体外蛋白修饰抗体法验证时,考马斯亮蓝染色的作用: 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝在酸性条件下为棕红色,其所含的疏水基团在酸性条件下雨蛋白质的疏水区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成蓝色的蛋白质染料复合物,在5
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问
胰蛋白酶分子印迹洗脱相关求助?
冷泉港蛋白
一、如果要从sds-page胶条拿到蛋白:蛋白与胶条之间相互作用力很弱,也不是离子相互作用,氯化钠作用不大。方法1.切胶,研磨,溶解。参考 蛋白胶条质谱鉴定的前处理方法2.进行横向电泳二、如果要从wb膜上拿到蛋白,就比较困难了,得考虑作用力了
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问
WB上样时,直接从孔里漏到两个胶交接的地方
bamboopiggy
是你上层胶没有凝固好吧,一般上层胶的凝固速度,要比管里剩下的胶要慢一些
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