实验室小助理夏奇
我是刚进入领域的小白,最近把好几个酶不同构建到pET-21a上,但是蛋白经过SDS-PAGE电泳检测,都出现了可溶性表达,但是用酶标法检测酶活的,显示都没有,实验步骤没有问题,因为同一批里的基因合成的有酶活,但是自己构建的都没有活性,希望各位大佬帮忙解答一下。
dxyc42u
有可能是酶标仪的问题,看看操作是否正确
土井挞克树
可溶性表达一般检测的是结构,无酶活可能是活性区域被改变。
loveliufudan
可能出现的原因如下:
蛋白质折叠不正确,导致酶活性丧失。可以尝试使用不同的表达条件(如不同的温度、IPTG浓度、培养时间等)或添加融合标签来增加蛋白质的稳定性和可溶性。
基因构建有误,导致酶活性丧失。建议仔细检查基因序列,特别是是否出现了意外的突变或插入缺失。
酶活性测定方法有误。可以尝试使用不同的酶活性测定方法来确认结果的可靠性。
可能与酶的天然结构相关。有些酶需要较特殊的结构来表达酶活性,可能需要更多的工作来研究如何使其正确折叠。
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