微管蛋白的可溶性表达及纯化

1、将重组质粒（BL21-2ß2或Rossatta-2ß2）的表达菌37℃摇培过夜后，1：20扩配（约需1h15m）；

2、至OD600=0.5~0.7时（约1h15min~1h45min），在15-（0.5-24，0.8-12）；20-（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）进行蛋白诱导表达，具体条件根据摇床使用情况而定；

3、对诱导后的菌液4℃，4000g，20min，彻底去上清；离心前取2ml以备用于总蛋白电泳分析S1；

4、细菌沉淀用BindingBuffer（无尿素，20mM咪唑）悬浮，100ml用5~10ml缓冲液（约当2~5ml每克菌量），视悬浮后的菌液浓度而定；

5、反复冻融法破碎细胞：做到14步时由于时间原因不能立即继续后面的操作，可将菌悬液放于-70℃冰箱中冷冻；也可用反复冻融的方法来破碎细胞，在-70℃冻融，在室温下溶解，反复冻融3~4次；

6、加Lysozyme至1mg/ml（1ml加10ul），在冰上孵育30min~1h；

7、200~300W超声破碎，2s×30次，停顿2s；若菌种较多可以增加破碎次数。注意超声破碎时间，不可太长，否则温度升高易导致蛋白变性；而时间太短则破碎不彻底，蛋白无法释放出来；

注意：第7步可选作，若经过冻融及溶菌酶处理后的菌悬液比较澄清，则可不用超声破碎。

8、4℃，10000rpm20~30min，取上清；将沉淀用变性的BindingBuffer（8M尿素）悬浮，然后室温摇动30min，取40ul进行电泳样制备S2；

9、4℃，10000rpm10min，对上清再离心一次，取40ul进行电泳样制备S3；

10、上清通过0.45um的细菌过滤器，取40ul进行电泳样制备S4；

11、用HisTrap纯化：

a）洗柱：用5倍柱床体积（5ml）纯水洗柱，避免产生气泡。

b）平衡：至少5mlBindingBuffer（20mM咪唑），一般10ml，流速在1ml/min。

c）上样：流速要慢要，控制在1ml/min，并收集流出的蛋白液，取40ul进行电泳样制备S5；

d）重新上样：对第一次上样流出的蛋白液再进行过柱一次，取40ul进行电泳样制备S6；

e）平衡：用10mlBindingBuffer（20mM咪唑），收集第一管及最后一管，各取40ul进行电泳样制备S7，S8。

f）洗脱：用5mlElutionBuffer（500mM咪唑）洗脱，每1ml一管，一般第一二管中蛋白多。

g）平衡：用5ml的BindingBuffer（20mM咪唑）平衡柱子；

h）封闭：用20%的乙醇封闭柱子，4℃保存。

若需进行咪唑浓度优化，则纯化步骤改为：

10、4梯度咪唑浓度洗脱：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500mM的咪唑进行洗脱，每个浓度各用4ml，收集第2、3V；电泳分析后确定最佳的咪唑平衡及洗脱浓度。

12、样品处理：吸取纯化后的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上样缓冲液，100℃水浴5min，12，000rpm离心3min后取上清点样，每个加样孔15ul。

13、80V电泳2h左右，取出胶用染色液染色4~5h（回收的染色液可过夜），用脱色液脱色3次，观察拍照。

附：

1、总蛋白电泳方法：700ul，12000g离心5min，弃上清，加入50霯1×蛋白上样缓冲液，充分悬浮，煮沸5min，12000g离心5min；

2、构建好的载体在进行蛋白诱导表达前，应选取10个左右的单克隆进行蛋白诱导的小量试验，对诱导后的总蛋白进行电泳分析，选取表达量最大的克隆保存（甘油菌，-70℃冰箱）；

3、从-70℃冰箱中活化菌进行蛋白诱导表达试验时，活化好的表达菌在4℃冰箱仅可存放15天左右，最多1个月，过期后必须重新划线活化。4℃冰箱保存的宿主菌每次用过后必须用封口膜封好。

4、SDS-PAGE分析的蛋白样：总蛋白样S1，沉淀中的蛋白样S2，离心后上清中的蛋白样S3，过细菌过滤器后的蛋白样S4，第一次上柱时流出的蛋白样S5，第二次上柱时流出的蛋白样S6，20mMBingdingbuffer过柱后的第一管S7和最后一管蛋白样S8。