重组的果蝇ACF的表达和纯化实验

1. 杆状病毒储液在感染前扩增几天。

为扩增病毒，Sf9 细胞以 2×10⁷ 细胞/皿植于 150 培养皿上，加入适当的有血清的培养液至25 ml， 并且以感染重数（MOD 为 0.1～0.5（每盘细胞加入 10～20 ul 病毒悬液）进行感染。为了获得病毒的储液储存，感染 60 h 并在无菌条件下收集培养液上清。对于高滴度的储液（将进一步用于表达感染），感染可以进行到细胞发生裂解为止（His－NAP－1 病毒约 72 h， ISWI 和 Acf1－FLAG 约 84 h）。这一过程产生的病毒储液的滴度接近或高于每毫升 10⁹ pfu。在无菌条件下吸出皿中的培养液，于 4℃ 避光保存在 50 ml 管中至少 12 个月，并且不会丧失明显的滴度。

2. 以 0.5×10⁶ 细胞/ml 接种 SF9 细胞至 150～500 ml 旋转式培养瓶中，并生长 2～3 天。将 SF9 细胞按照 2.5×10⁷～3×10⁷ 细胞/皿分到 5～25 个平皿中，每皿加入适当的昆虫培养基至 25 ml。在组织培养箱中放置 20 min，使细胞沉降，用重组的 Acfl－FLAG 和 ISWI 杆状病毒以 MOI 为 5～10 感染细胞。

3. 感染 44～46 h 后，吸出培养液并用 10 ml 冰冷的 PBS 每皿将细胞冲洗下来。在 250 ml 锥形瓶或 50 ml 管子中使用临床离心机 4℃，2000 r/min 离心 5 min。

4. 在冷室或于冰上操作，用 8 ml 裂解缓冲液 F 重悬细胞，用 Wheaton 杜恩斯匀浆器 破碎细胞（使用 A 型研磨棒；于冰上， 在 30 min 内，10 次匀浆进行 3 遍）。

5. 4℃， 在 14 ml —次性锥形离心管中 14 500 g （SS－34 转子 11 000 r/min） 离心 10 min 沉淀不溶物。在上清液中加入 250 FLAG－M2 树脂（经裂解缓冲液 F 平衡的 1：1 的悬浮液）和 7 ml 稀释缓冲液 F。混合液在 15 ml 带盖聚丙烯管中 4℃ 于摇床上混匀 3～4 h。

6. 洗涤树脂 4 次，每次使用 12 ml 洗涤缓冲液 F，接着于 4℃，在临床离心机上 2000 r/ min 离心 3 min，吸去上清并重悬。

7. 按如下步骤洗脱蛋白质：

7.1 在步骤 6 的树脂沉淀中加入 100 洗脱缓冲液 F 重悬树脂。

7.2 将树脂转移到 1.5 ml 硅烷化的微量离心管中。

7.3 冰浴 10 min。

7.4 以最大转速离心 30 S。

7.5 将上清转移到另一个管子中（与下一步的洗脱液混合）。

7.6 继续在同一个硅烷化的微量离心管中再重复步骤 7.1、7.3、7.4、7.5 3 次，将所有的洗脱液混合到一起。

8. 将蛋白质分装（每管 20～50），用液氮速冻并于 -80℃ 保存。

9. 可选：将蛋白质与一系列标准浓度的 BSA 同时进行 SDS-PAGE 电泳，并进行考马斯亮蓝 R－250 染色，以估计蛋白质的浓度。