重组毕赤酵母的表达
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实验步骤
1. Mut 胞内或分泌表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal (Mut )(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115 或KM71 作为胞内表达背景对照。
1) 挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时)。
2) 室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)。
3) 在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。
4) 每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。
7) 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。
2. Muts胞内或分泌表达：可培养GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115 或KM71 作为胞内表达的背景对照。
1) 挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG 或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时)。
2) 室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY 重悬细胞(约10-20ml)。
3) 置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。
7) 用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。
任何标准SDS-PAGE 仪器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝胶，5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。样品准备：需要准备Breaking 缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠。
2) 每1ml样品，加入100ul裂解缓冲液(细胞 上清)。
3) 加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过置换来估算相等体积。
5) 4度最大转速离心10min，将上清转移至干净的微量离心管中。
6) 取50ul上清(细胞裂解物)，加入50ul 2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer)。
7) 煮沸10min，每孔加10-20ul，依胶的厚薄及孔量，决定点样量。剩下样品存于-20 度，用于western blot。细胞裂解物存于-80度用于分析。
