毕赤酵母中的表达实验

一、培养基和微生物操作技术

在 实 验 室 水 平 培 养 毕 赤 酵 母 菌 及 其 他 大 部 分 酵 母 菌 的 技 术 与 培 养 大 肠 杆 菌 和 酿 酒 酵母 菌 类 似 。最 常 用 的 丰 富 培 养 基 是 Y P D [ 1 % 酵 母 提 取 物（yeast extrac0 、2 % 蛋 白 胨(peptone) 、2 % 葡 萄 糖（dextrose) ] 培 养 基 ，最 常 用 的 确 定 成 分 培 养 基 是 Y N B 培 养 基0. 6 7 % 的 含 硫 酸 铵 不 含 氨 基 酸 的 酵 母 氮 源（yeast nitrogen base) 、2 % 葡 萄 糖 、50 p g / m L的 任 何 生 长 必 需 的 氨 基 酸 和 核 苷 酸 ]。必 赤 酵 母 利 用 甲 醇 生 长 时 需 要 将 培 养 基 中 的 葡 萄 糖替 换 成 0 . 5 % 的 甲 醇 。交 配 /产 孢 (mating/spomlation) 培 养 基 由 0 . 5 % 乙 酸 钠 、1 % 氯 化 钾 、1 % 葡 萄 糖 组 成 。培 养 基 中 加 入 2 % 琼 脂 后 可 以 制 成 培 养 平 板 (Petri plate)。培 养 通 常 在30°C 进 行 。在 Y P D 液 体 培 养 基 中 ，毕 赤 酵 母 的 代 时 大 约 是 90 m i n ; 在 确 定 成 分 的 培 养 基 中代 时 大 约 是 3 h 。如 果 甲 醇 作 为 唯 一 碳 源 ，那 么 在 确 定 成 分 培 养 基 中 的 代 时 大 约 是 5 h 。

二、遗传株的构建

尽管毕 赤 酵 母 有 多 种 类 型 的 标 志 物 (marker)，但 满 足 研 究 人 员 的 目 标 标 志 物 组 合 可能 并 不 存 在 。因 此 ，构 建 一 套 具 有 最 理 想 标 志 物 的 宿 主 菌 是 很 有 必 要 的 。构 建 菌 株 的 第— 步是 交 配 并 筛 选 二 倍 体 (diploid)(Tolstorukov and Cregg, 2008)。 因 为 毕 赤 酵 母 在 功能 上 是 同 宗 结 合 的 (homothallic), 且 同 株 的 细 胞 间 也 会 发 生 交 配 ，因 此 在 计 划 进 行 交 配 时不 用 考 虑 菌 株 的 交 配 型 。但 是 , 毕 赤 酵 母 间 的 交 配 效 率 较 低 ，因 此 进 行 交 配 的 菌 株 具 有 互补的标记是非常必要的，这些标记能够允许杂交产生的二倍体选择性生长但抑制自身交配产生的二倍体和亲代株的生长。营养缺陷（auxotrophic) 标记在使用时最为便利。但是能够影响生长或其他表型的基因突变，如影响对甲醇或某种氮源（甲胺) 利用的基因突变也是很好的标记。下面是毕赤酵母交配的操作步骤。

1. 交 配 ，生成二倍体

(1)首先 从 Y P D 平板上挑取待交配菌株的新鲜克隆 (不要超过 1 周），然 后 在 另 外 2块 Y P D 平板上分别划出多条平行的菌线。

(2) 30°C 培养过夜，将 2 块划线平板上的酵母菌转移到 1 块无菌的丝绒布上, 此时，要 使 2 块平板上的菌线互相垂直。

(3) 将丝绒布上互相交叉的菌线转移到交配/孢子生成平板上，室 温 下 培 养 2〜3 天后开始交配。

(4) 在培养后，将交配/孢子生成平板上的酵母菌影印复制到另一个含有合适培养基
的琼脂平板上筛选互补的二倍体。二倍体克隆会在 30°C 孵 育 2〜3 天后长在划线的交叉处 。毕赤酵母二倍体的大小大约是单倍体的 2 倍 ，通过光学显微镜可以依据孢子的大小和较高的孢子生成效率来辨识。

(5) 在二倍体选择培养基上通过划菌线的方法得到二倍体的单克隆。

(6) 在缺少氮源的情况下，毕赤酵母二倍体能高效地进行减数分裂并生成孢子。为
了使二倍体进入这种生命状态，用平板影印法或用接种环直接将新鲜二倍体克隆 (生长在添加有葡萄糖的 Y P D 平板上) 转移到交配/孢子生成平板; 在室温培养 3〜4 天 。所有生成孢子的毕赤酵母在孢子囊中会聚集红色色素，因此生成孢子褐色的二倍体可以很容易地与相对白色的单倍体区别开来。还可以通过普通显微镜或相差显微镜观察培养中出现的大量子囊 (a s d) 来辨识出二倍体。

2. 随机孢子分析

毕赤酵母孢子很小且彼此黏在一起。这使得通过显微操作技术分离四分孢子（ tetrad dissection) 变得很难。因此，获得的孢子需要进行随机孢子分析 ( r a n d o m spore analysis，R S A )，过程如下所述。

( 1 ) 用接种环将毕赤酵母孢子 (来自上一过程第 6 步) 转移到装有 0. 25 m L 无菌水的I.5 m L 离心管中，涡旋振荡混匀。

(2) 在通风橱中向孢子样品中加人 0. 25 m L 二乙醚 (diethyl ether), 室温彻底祸旋振荡 大 约 5 m i n 。用乙醚处理可以选择性的杀死存留在孢子中的营养体。

(3) 仍然在通风橱中，离 心 2 m i n ，吸出上层的乙醚，用下层的水重悬孢子沉淀。取出10 uL 或 I O O uL 重悬液涂布到非选择 Y P D 平板。

(4) 30°C 培养 4〜5 天 ，挑取单克隆在新鲜 Y P D 平板上划线，作为进一步分析用的主平板（master plate)。

(5) 将主平板上的菌落影印复制到含有合适分析培养基的一系列平板上。或者, 直
接影印复制最初的平板上的 1 〇〇 〜600 个克隆。例 如 ，h 1 S4 菌 株 和 arg4 菌株交配后获得的孢子可以在添加有葡萄糖的 Y N B 培养基中进行分析。该培养基中的氨基酸添加情况如下:①不添加氨基酸;②添加精氨酸;③添加组氨酸;④添加精氨酸和组氨酸。

(6) 比较鉴定平板上各个克隆的表型以发现具有所要表型的克隆。

(7) 选择若干具有合适表型的克隆在非选择性培养 (如 Y P D ) 平板上划线, 从每个克隆划线产生的单克隆中挑取克隆，单个克隆在同一套鉴定平板上重新鉴定。该步骤非常重要，因为毕赤酵母的孢子一个挨一个非常紧密的黏附在一起, 因此其萌发产生的克隆通常包含从不止一个孢子分化出来的细胞。孢子聚集的另一个结果是标记基因并不是按照I : 1 的比例分离 (segregate), 而是倾向于显性 (dominant) 表型或野生型表型。例 如 ，上述 his4 菌 株 和 arg4 菌株交配时，His⁺A r g ⁺ 表 型 的 孢 子 所 占 比 例 超 过 预 计 的 2 5 % ，而His^- A r g ^- 表型的孢子数量则低于预期。

三、基因制备和载体选择

在选择毕赤酵母表达载体时首先要考虑的是需要分泌表达还是胞内表达。一 般的经
验做法是与该蛋白质在天然宿主中的表达途径一样: 如果天然宿主是胞内表达该蛋白质,那么就应该在酵母菌中胞内表达; 如果天然宿主是分泌表达该蛋白质, 那么就在酵母菌中分泌表达。尽管存在例外, 但是最好还是遵循这个规则，因为胞内和分泌的环境非常不同，如果在不合适的空间合成蛋白质将导致其错误折叠和失活。人们构建了一系列的载体用于毕赤酵母的表达，这些 载 体 的 名 称 和 详 细 信 息 可 以 在 Lin-C e r e g h i n o 和 Lin C e -reghino(2008) 及 littp://w w w .biogrammatics,c o m (图 13. 1) 中找到。

为了将一段基因克隆人毕赤酵母的表达载体中，可以使用合适的引物通过聚合酶链反应对模板进行扩增。当 D N A 需要优化或基因需要改变的时候，从头合成法可以使克隆变得简单。在任何情况下，在基因末端都要加上限制性酶切位点以方便克隆。例 如 ，E c o R I 位点可以加在基因 5 ¾ (含有 A T G )，JV 〇 ( I 位点可以加在 3’端, 这样就可以很方便地克隆人 p P I C Z 系列载体(Invitrogen， Carlsbad，C A ) 中，当然，前提是所要克隆的基因序列上不存在这些酶切位点。对 来 自 Biogrammatics 公司的毕赤酵母表达载体来说，基因两侧可以添加 11S 型限制性内切核酸酶的酶切位点和「无缝」克隆序列以构建一个理想的克隆表达载体。

克隆一个分泌蛋白的基因要更复杂一些。当使用该蛋白质的天然分泌信号时克隆过程与胞内表达时一样; 但是, 当使用外源信号序列时就会面临一些选择，如表达载体上有酿酒酵母 a 交配因子 (aM F ) 的分泌信号，此 时 ，插入的目标基因就必须要与该信号肽的编码序列形成一个正确阅读框。《交配因子分泌信号常用于分泌表达，因为已经证明它能够很好地分泌表达多种重组蛋白。尽管用《M F 可以成功地分泌表达重组蛋白，但有时在目标蛋白质的 N 端 aM F 不能被正确地加工。此时 ，需 要 对 aM F 进行修饰或用其他的分泌信号才能获得正确加工的蛋白质。为了正确地加工蛋白质，《M F 信号肽序列和目标蛋白质 N 端之间或许需要插人两个谷氨酸-两氨酸重复序列。 Biogr a m m a t i c s 的载体 p J A Z -a M F 可以用来构建含有谷氨酸-丙氨酸重复序列的重组体。 Biogr a m m a t i c s 的其他载体,如 p J A Z -a M F -K R , 它在克隆位点上不含有谷氨酸和丙氨酸重复序列。要 想 在 p P I C Z a 载体上利用 a M F 信号，必须在基因的 5’端添加一定的序列，这样当将外源序列连接到载体上时，aM F 信号序列可以得到重建 (不管 aM F 中是否含有谷氨酸-丙氨酸重复的编码序列）。通常 ，用于切割 p F I C Z 载 体 的 X A o [位 于 a M F 信号序列中，为了重建信号序列，需要合成一段寡聚核苷酸：

「A B C D E F …」表示编码成熟重组蛋白第 1 个 和 第 2 个氨基酸残基的核苷酸序列。这个寡聚核苷酸将与成熟蛋白的基因的 5’端形成正确的连接，同时恢复了 aM F 序列缺失的部分。类似的, 用于将基因克隆到 Biogrammatics 载体中的无缝克隆技术使用 I I S 型限制性酶切位点，将 A B C D E F 与 aM F 信号肽序列的 C 端最后一个丙氨酸 (A l a) 的编码序列连接起来。该酶产生了一个 4 个碱基的黏端，这 4 个碱基包括了谷氨酸 (G l u ) 的最后一个编码核苷酸和丙氨酸 (Ala) 的编码核苷酸。

四、电穿孔转化法

目前至少有 4 种 不 同 的 方 法 可 以 将 外 源 质 粒 D N A 导 人 毕 赤 酵 母 中 ： 原生质体(spheroplast-generation) 转 化 法 、氯 化 锂（L i C l) 转 化 法 、 P E G 1000 (polyetheleneglycollOOO) 转化法和电转化法 (electroporation)。电转化法是最常用的，因此，在此详细列 出 Becker 和 Guarante 改良的电转化法的操作步骤。至于其他方法，读者可以参考分
子生物学方法毕赤酵母卷 (Cregg， 2008; HigginsandCregg, 1998)。

五、DNA 的制备

对 于 所 有 的 转 化 方 法 ，为 了 将 外 源 D N A 整 合 到 毕 赤 酵 母 基 因 组 中 ，人 们 通 常 使 用 线状 质 粒 D N A 。线 状 质 粒 D N A 末 端 的 序 列 与 宿 主 基 因 组 整 合 位 点 的 序 列 同 源 ，通 过 一 次单 交 换 完 成 外 源 序 列 的 插 入 。因 此 ，质 粒 的 线 性 化 位 点 通 常 都 位 于 质 粒 上 与 毕 赤 酵 母 基因 组 同 源 的 部 分 , 如 在 启 动 子 序 列 内 (AOXI 沿 启 动 子 的 P m e I 位 点 ）。使 用 大 肠 杆 菌 制 备质 粒 后 ，用 限 制 性 内 切 核 酸 酶 使 其 线 性 化 ，经 纯 化 和 浓 缩 后 其 终 浓 度 至 少 为 1 〇 〇 n g /uL(溶 于 水 中）。至 此 ，转 化 毕 赤 酵 母 用 的 载 体 就 准 备 好 了 。

电 转 感 受 态 细 胞 的 制 备 步 骤 (Lin-Cereghino et a L ，2005)。

1. 实 验材料 (除了 D T T 和 H E P E S 过滤除菌外，所有的溶液都要高压灭菌）

( 1 ) 在 2. 8 L 的 冯 巴 赫 (Fernbach) 摇 瓶 中 配 制 500 m L 的 液 体 Y P D 培 养 基 。

( 2 ) 水 (1 L ) 。

(3) I m o l / L 山 梨 醇 (sorbitol) (100 m L ) 。

(4) 适 量 的 筛 选 用 琼 脂 平 板 。

(5) I m o l / L 二 硫 苏 糖 醇 (D T T ) (2.5 m L ) 。

(6) B E D S 溶 液 (9 m L ):10 m m o l /L i V -二 羟 乙 基 甘 氨 酸 -氢 氧 化 钠（bicine^N a O H ),p H 8. 3 , 3 % 乙 二 醇（ethylene glycol) ， 5 % 二 甲 基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，D M S O ) ，
I m o F L 山 梨 醇 ，0•I m o l / L D T T 。

(7) I m o l /L 羟 乙 基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 (H E P E S ) 缓 冲 液 ，P H 8. 0(50 m L ) 。

(8) 无 菌 的 250 m L 离 心 管 。

(9) 无 菌 的 电 转 杯（electroporation cuvette) 。

( 1 0 ) 电 转 仪 ：B T X Electro Cell Manipulator 600 (B T X ， San D i e g o , C A );Bio-RadG e n e PulserCBio-R a d , Hercules, C A ) ；Electroporator II (Invitrogen， S a n D i e g o , C A ) 。
电 转 参 数 因 仪 器 型 号 不 同 而 有 所 不 同 。使 用 前 请 阅 读 对 应 型 号 的 说 明 书（Becker andG u arante, 1991； G r e y and Brendel, 1995； Pichia Expression KitInstruction M a n u a l ；
Stowers et al. , 1995)。

2. 操作方法

(1) 挑 取 在 琼 脂 平 板 上 的 新 鲜 毕 赤 酵 母 单 克 隆 接 种 在 10 m L Y P D 培 养 基 中 ，30°C 振荡 培 养 过 夜 。

(2) 将 过 夜 培 养 的 酵 母 菌 接 种 到 装 有 500 m L Y P D 的 2. 8 L F e r a b a c h 培 养 瓶 中 ，此时 〇D _600nm, 大 约 为 0•0 1 ，培 养 至 O D _600nm为 I.0 左 右 (大 约 12 h ) 。

(3) 4°C 2000 g 离 心 收 集 细 胞 ，弃 上 清 液 ，用 1 〇〇 m L 含 有 H E P E S ( p H 8.0,200 m m o l /L ) 的 Y P D 培养基重悬沉淀，转 移 到 250 m L 离心管中。

(4) 加 入 2. 5 mL 的 I mol/L DTT，轻柔混匀。

(5) 30°C 缓慢旋转孵育 15 m i n 。

(6) 向培养物中加入 150 mL 冷水，4°C 离心; 再用 250 mL 冷水离心清洗。从这步开始 ，保持细胞在冰冷环境中并且不要振荡重悬细胞 (最好用吸管缓慢吹打)。

(7) 用 20 mL 冷 的 I m 〇 l/L 山梨醇洗细胞，然 后 用 0.5 mL冷的Im ol/L 山梨醇重悬 (细胞悬液的终体积为 I.0〜I.5 mL)。

(8) 直接使用这些未经冷冻的感受态细胞能获得最多的转化子。

(9) 每 个 I.5 mL 离心管分装 40 pL 感受态细胞, 置于一 70°C 冻存。

3. 电 转 步 骤

(1) 将 I ug 溶于水的线状质粒 DNA(体积不要超过 5 ML) 加人装有 40 uL 冻存的或新鲜的感受态细胞的离心管中，将混合物转移到在冰上预冷的 2 mm 内径的电转杯中。

(2) 用电转仪制造商建议的针对酵母的参数进行电转 (表 13. 1)。

(3) 电击后立即加人 0. 5 mL 预 冷 的 I mol/L 山梨醇和 0. 5 mL 预冷的 YPD，然后将电转杯中所有的菌液转移到一个 1. 5〜2. 0 mL 的离心管中。

(4) 将离心管置于 30°C 缓慢摇动 (100 r/min)，培 养 3. 5〜4 h。

(5) 取 1 份电转产物涂布在选择性琼脂平板上，培 养 2〜4 天。

(6) 为了避免混合克隆, 在进行下一步分析之前，至少需要再一次挑单克隆在选择培养基上划线培养以获得单克隆。

4. 电 转 感 受 态 毕 赤 酵 母 的 快 速 制 备

(1) 在 5 mL YPD 培养基中接种毕赤酵母，30°C 摇动培养过夜。

(2) 在 装 有 50 mL YPD 培养基，能良好通气的大培养瓶中，稀释过夜培养的毕赤酵母菌液至 OD_600nm 0. 15〜0. 20。

(3) 30°C 摇动培养至 OD_600nm〇.8〜1. 0(4〜5 h)。

(4) 室 温 5OOg 离 心 5 min 收集菌体，弃掉上清液。

(5) 在加 有 DTT 的 9 mL 预冷 的 BEDS 溶液中重悬沉淀。

(6) 30°C 摇 动 孵 育 重 悬 液 5 m i n 。

(7) 室 温 500 g离心 5 m i n 收 集 菌 体 ，用 I m L B E D S 重 悬 (不 含 有 D T T ) 。

(8) 按 照 上 述 电 转 化 步 骤 进 行 电 转 , 或 者 立 即 分 装 细 胞 并 将 其 冻 存 在 一 80°C 。

六、重组蛋白表达菌株的鉴定

酵 母 表 达 系 统 已 经 成 功 地 用 于 重 组 蛋 白 的 大 量 制 备 ，如 I L 酵 母 培 养 液 上 清 液 中 能够 获 得 1〜 10 g 分 泌 表 达 的 重 组 蛋 白 。但 是 ，可 能 在 初 次 尝 试 表 达 时 不 能 够 在 考 马 斯 亮蓝 染 色 的 凝 胶 中 看 到 目 标 蛋 白 质 的 条 带 。因 此 ，非 常 有 必 要 在 使 用 构 建 好 的 重 组 菌 株 进行 蛋 白 质 表 达 前 ，准 备 好 一 种 或 多 种 更 为 灵 敏 的 检 测 方 法 。可 以 利 用 目 标 产 物 的 酶 活 性 、目 标 产 物 上 融 合 的 表 位 标 签 或 目 标 产 物 的 特 异 性 抗 体 来 进 行 检 测 。但 关 键 在 于 : 建 立 灵敏 检 测 方 法 的 工 作 应 该 与 表 达 同 时 进 行 或 先 于 表 达 进 行 。如 下 例 所 示 ，好 的 检 测 方 法 能够 大 大 方 便 菌 株 的 构 建 。

检 测 酵 母 表 达 的 外 源 蛋 白 最 便 捷 的 方 法 是 平 板 活 性 实 验 。该 实 验 可 以 进 行 粗 略 的 定量 。通 过 平 板 影 印 或 别 的 技 术 将 菌 落 影 印 到 另 一 个 平 板 上 ，能 够 对 100〜 1 0 0 0 个 转 化 子的 表 达 水 平 进 行 直 接 比 较 。

图 I3. 2 显示了 使 用 平 板 活 性 实 验 检 测 分 泌 表 达 的 肌 醇 六 憐 酸 酶（phytase) 的 例 子 。这 种 酶 可 降 解 肌 醇 六 磷 酸 (phytate)，它 能 使 琼 脂 平 板 上 表 达 该 酶 的 酵 母 克 隆 的 周 围区域变 得 澄 清 。澄 清 区 域 的 大 小 与 肌 醇 六 磷 酸 酶 的 分 泌 量 相 关 。第 二 个 例 子 ，毕 赤 酵 母 胞 内表 达 细 菌 β-内酰胺酶 (β-lactamase)( 图 13.3)。 通 常 毕 赤 酵 母 的 克 隆 呈 黄 色 ，表 达 斤 内 酰胺 酶 时 会 由 粉 色 转 为 紫 色 。紫 色 的 深 度 与 酶 的 表 达 量 有 关 ，在 这 里 ，也 就 是 与 菌 株 的 表 达框 的 拷 贝 数 有 关 。最 后 指 出 ： 如 下 所 述 ，可 以 用 高 质 量 的 针 对 标 签 区 域 或 重 组 蛋 白 自 身 的多 克 隆 抗 体 或 单 克 隆 抗 体 进 行 平 板 抗 体 实 验 或 酵 母 印 迹 实 验 。

转 化 子 被 筛 选 出 来 后 ，分 离 出 单 细 胞 并 收 集 在 作 为 主 平 板 的 平 板 上 ，来 源 于 多 个 转 化子 的 样 品 将 被 用 于 检 测 外 源 蛋 白 的 表 达 情 况 。在 这 之 前 ，可 以 通 过 PCR 筛 选 含 有 重 组 基因 的 转 化 子 。如 下 所 述 ，用 玻 璃 珠 破 碎 法 在 无 细 胞 抽 提 系 统 中 提 取 出 基 因 组 D N A ，用 其作 为 模 板 ，使 用 与 重 组 基 因 两 侧 互 补 的 引 物 进 行 PC R 反 应 。根 据 使 用 何 种 启 动 子 表 达 蛋白 (诱 导 型 的 和 组 成 型 的 ) 和 使 用 哪 种 表 达 载 体 (胞 内 的 或 分 泌 的），有 不 同 的 检 测 方 法 用于 表 达 蛋 白 的 检 测 。

( 1 ) 如 果 目 的 基 因 的 表 达 是 组 成 型 的 ，接 种 单 克 隆 在 YPD 培 养 基 中 ，良 好 通 气 的 情况 下 培 养 2 〜3 天 ，在 这 段 时 间 里 可 以 用 各 种 可 行 的 检 测 方 法 在 不 同 的 时 间 点 分 析 蛋 白 质的 表 达 。

( 2 ) 对 于 甲 醇 诱 导 型 表 达 ，首 先 在 Y PD 培 养 基 中 接 种 单 克 隆 并 培 养 17〜 24 h ，然 后转 移 到 添 加 有 甲 醇 的 新 鲜 培 养 基 中 诱 导 。诱 导 时 通 气 要 好 , 菌 的OD_600nm在 1 0 左 右 ，在装有 2 n iL 培 养 基 (含 有 0 . 5 % 甲 醇 ) 的 15 m L 试 管 中 进 行 。对 于 胞 内 表 达 的 蛋 白 质 ，甲醇诱 导 6〜 12 h 就 足 够 了 。

胞内表达的样品需要制备细胞提取物后进行分析。收集培养 10〜12 h 的酵母菌，使用玻璃球破碎法裂解细胞。准 备 10〜50 个 OD_600nm单位的细胞, 用 150 uL 裂解缓冲液重悬 。加人等体积用无菌的酸洗过的直径 0.45 m m 的玻璃球。最大转速涡旋振荡混合I m in, 然后将混合物放置冰上 I m in; 重复上述操作至少 5 次。或者将装有样品的离心管放置在可以容纳多个离心管的涡旋振荡器中。将振荡器置于 4℃；冰盒中或冷室中，以最高速振荡大约 10 m in。在显微镜下检查细胞的破碎情况，此时, 应该可以观察到 8 〇%〜9 0 % 的细胞已经破碎。细胞破碎后，将细胞碎片和缓冲液一起转移到一个新的离心管中，另 用 100 uL 裂解缓冲液振荡清洗玻璃球然后将洗液转移至上述同一离心管中。 4℃高速离 心 5 m i n ，将包含目标蛋白质的上层水相转移到新离心管中。 这 就 是 用 于 S D S -p A G E 、蛋白质印迹或酶学分析的粗提蛋白质样品。

分 泌 蛋 白 在 培 养 基 中 积 累 很 缓 慢 ，至 少 要 培 养 2 天 才 能 达 到 高 峰 。可 以 振 摇 诱 导 2〜5 天 ，期 间 每 12 h 加 入 新 鲜 甲 醇 至 终 浓 度 为 〇 •5 % 并 收 集 50〜 100 上 清 样 品 。上 清 样品 可 以 进 行 SDS-PAGE、蛋 白 质 印 迹 或 酶 学 反 应 分 析 ，也 可 以 一 20°C 冻 存 。

七、分 析 方 法 的 建 立 —酵母印 迹 法

使用抗体的各种不同分析方法有许多相似之处。酵母克隆蛋白质印迹法是一种很有用的、酵母特异性的抗体分析方法。它有时候被称为分泌蛋白的酵母印迹法 (「Yeastem」Blot)(图 13. 4)。对于标准的蛋白质印迹法操作步骤，请 参 考 Sam brook 等 (1989)。

酵 母 印 迹 是 一 种 很 便 捷 的 直 接 在 平 板 上 大 量 筛 选 重 组 蛋 白 表 达 菌 株 的 方 法 。但 是 ，读 者 应 该 明 白 ，克 隆 周 围 光 晕 的 大 小 和 重 组 蛋 白 的 量 并 不 总 是 线 性 相 关 ，这 种 方 法 得 出 的所 有 结 果 都 应 该 用 标 准 的 蛋 白 质 印 迹 法 或 其 他 的 检 测 方 法 加 以 验 证 。酵 母 印 迹 法 的 操 作步 骤 如 下 所 述 。

( 1 ) 将 琼 脂 平 板 表 面 的 新 鲜 酵 母 克 隆 用 标 准 的 平 板 影 印 法 转 移 到 一 张 无 菌 的 Whatman No. 1 滤 纸 上 。滤 纸 应 剪 成 大 小 能 刚 好 放 进 平 板 中 。

( 2 ) 将 粘 有 酵 母 细 胞 的 滤 纸 放 在 含 有 适 量 诱 导 培 养 基 的 新 鲜 平 板 表 面 ，然 后 培 养 1〜2 天 。

( 3 ) 准 备 一 张 大 小 和 上 述 滤 纸 一 样 的 硝 酸 纤 维 素 膜 ，用 至 少 15 m L 电 转 缓 冲 液[25mmol/L Tris(pH8.5),0.2 111 〇 1/乙甘氨酸，20% 甲 醇 将 该 膜 浸 泡 5min或更长时间。在 电 转 缓 冲 液 中 再 浸 湿 两 张 剪 好 的 滤 纸 。

( 4 ) 按 照 下 述 方 法 准 备 滤 纸 和 硝 酸 纤 维 素 膜 的 三 明 治 。

① 将 一 张 滤 纸 放 置 在 印 迹 装 置 的 阳 极 (移 除 膜 之 间 的 所 有 气 泡 是 很 有 必 要 的 ，可以用 移 液 管 在 滤 纸 表 面 滚 动 去 除 气 泡）。

② 将 浸 湿 的 硝 酸 纤 维 素 膜 放 在 滤 纸 上 。

③ 将 影 印 有 平 板 上 酵 母 细 胞 的 滤 纸 放 在 硝 酸 纤 维 素 膜 的 上 面 。

④ 放 置 第 二 层 浸 湿 的 滤 纸 在 有 酵 母 细 胞 的 滤 纸 上 层 。

⑤ 最 后 ，将 阴 极 板 放 在 三 明 治 的 最 上 层

(5) 用恒定的电流 (1〜4 mA/cm2) 作 用 I h 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。

(6) 移走硝酸纤维素膜，将 其 在 15 m L 的 T B S 缓 冲 液 [50 m m d/L Tris-HCKpH7.6), 150m m ol/L 氯化钠] 中洗 5 m in。之后, 将 T B S 缓冲液换成含有 1% 〜5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 TBST(加 Tween-20 在 T B S 至终浓度为 0. 0 5 % ) 。置硝酸纤维素膜于封闭缓冲液中, 室温缓慢摇动 I h 。

(7) 将滤膜转移到 15 HiL T B S T 中室温摇动 5 m in。

(8) 准 备 好 15 mL 封 闭 缓 冲 液 稀 释 的 一 抗（按 照 供 货 商 推 荐 用 量 稀 释 ，一般为0.5 ug/mL)。

(9) 将膜和一抗在 2〜8°C 缓慢摇动孵育过夜 (也可以根据所用抗体，缩短至在室温下孵 育 1〜3 h)。

(10) 用 15 mL T B S T 缓冲液至少洗膜 4 次 (每 次 5 min)，最后用新鲜 T B S T 快速冲洗 膜 。

(11) 根据供货商推荐的用量在封闭缓冲液中稀释酶标二抗 (一 般 在 15 m L 封闭缓冲液 中 加 3 ， 抗体)。

(12) 将稀释的二抗和膜于室温摇动孵育 I h 。

(13) 重复步骤 (10)。

(14) 在暗室中，根据供货商的建议，使 用 显 色 剂（visualization reagent) 处 理 膜（如Pierce E C L 蛋白质印迹底物），然后用滤纸移除膜上多余的液体，将膜放置在塑料的保护盒 中 ，使 用 X 射线感光胶片对整张膜曝光 30 s 至数分钟。每个克隆周围的信号强度和大小大致可以反映出该克隆/菌株表达分泌重组蛋白的水平。

八、重组蛋白的翻译后修饰 (蛋白酶和糖基化）

在毕赤酵母中包括蛋白酶解和糖基化在内的翻译后修饰会影响重组蛋白的质量。

如果最初的 SDS-P A G E 分析显示目标蛋白质发生了降解, 那么可以尝试毕赤酵母的蛋白酶缺陷株。较低的重组蛋白表达水平和有活性的或有免疫活性的产物小于全长产物显示蛋白酶发生了降解。降解的蛋白质也可能在 P A G E 电泳上显示为弥散的条带，条带分布在从分子质量的正常大小到较小的位置。毕赤酵母菌株 SMD1168(pep4 his4) 的大部 分 P E R 基因被删除 (Gleeson et al.， IM S)。该基因负责活化毕赤酵母液泡中的许多蛋白酶。这些蛋白酶最初以非活性的酶原形式进入液泡，在 液 泡 中 被 P £T 4 产物激活。尽管分泌型的重组蛋白不会进人液泡，但是它们在培养基中会接触到小量细胞裂解后释放的此类蛋白酶毕赤酵母在培养时的密度非常高, 这会导致在培养基中的液泡蛋白酶浓度达到不能忽视的水平。为 了 利 用 PEP4 菌株进行表达，你要么使用你的质粒转化SMD1168(p 印 4 his4) 或 SMD1168 H (pep4) 等菌株，要么在已经表达目标蛋白质的菌株上删 除 基因。 为了确定缺失PEP4 对蛋白质表达是否有利，需要在平行诱导完成后对 野 生 型 和 缺 失 株 表 达 的 重 组 蛋 白 进 行 检 测 。注意:平板上保存的 P E P 4 缺失株会更快死亡，而且不如野生型菌株容易转化，生长得更慢，在甲醇培养基中更难诱导，尤其是 P f P4 缺失菌株很难与其他非 P E P 4 毕赤酵母菌株交配。

如 果 S DS- P A G E 显 示 毕 赤 酵 母 中 表 达 的 重 组 蛋 白 较 预 期 的 大 ，或 者 大 小 不 一 ，那么该 蛋 白 质 可 能 被 糖 基 化 了 。你 应 该 首 先 检 査 氨 基 酸 序 列 以 寻 找 潜 在 的 糖 基 化 位 点 :A S N -X -S e r / T h r 序 列 是 存 在 JV-糖 基 化 的 信 号 ; 任 何 S e r 或 T h r 位 点 的 一 O H 基 团 都 可 能 出 现O 糖 基 化 。可 以 用 肽 N-糖 苷 酶 F (FPNGaSe F ，peptideN -glyc 〇 sidase F ) 处 理 可 疑 的 糖基 化 蛋 白 以 去 糖 基 化 ，然 后 通 过 S D S ^ P A G E 对 产 物 大 小 进 行 检 测 。 从 http://www.neb.com/nebecomm/piroducts/productP0704. asp 可 以 找 到 一 个 很 好 的 蛋 白 质 去糖 基 化 的 方 法 。如 果 经 过 糖 苷 酶 处 理 后 蛋 白 质 的 分 子 质 量 变 小 ，而 且 更 为 均 一 ，那 么 几 乎可 以 确 定 这 个 蛋 白 质 是 被 糖 基 化 了 。

九、挑 选 具 有 多 拷 贝 表 达 框 的 克 隆

在毕赤酵母表达系统中，最常用的增加重组蛋白表达量的方法或许就是增加菌株中
表达框（expression cassette) 的拷贝数（Brierley，1998; Thill et al.，1990)。有两种方法可以用来构建具有多拷贝表达框的菌株。第一种方法是构建一个拥有多个头尾相接的表达框 (Brierley，1998) 的载体。构建这个载体的关键是载体的表达框的两侧有限制性内切核酸酶的酶切位点, 而且必须能够切出互补的末端（如 Baw HI-B g m 、SaZI-X/io I 这样的组合）。重复进行切开和插人的操作会产生一系列表达框拷贝数逐渐增多的载体。这种方案有一个独有的优势 (尤其在人用药物制品方面） ，即表达框的确切数量非常清楚，而且可以通过 D N A 测序进行直接确认。

这种筛选方法的一个缺点是很难获得足够多的克隆用于筛选含有高拷贝表达框的菌
株 。首先 ，耐高浓度药物的转化子数量很低，通常只占低耐药性 (1 〇〇 ug/m L 的抗生素)转化子数量的〇.1 % 〜1. 0 % 。因此，只有在最高转化效率的情况下，才可能会有耐高浓度药物的转化子出现。其 次 ，需 要 50〜100 个转化子来筛选高拷贝菌株，这是因为在显示高耐药性的转化子中，只 有 1 % 〜5 % 是由于细胞内具有多拷贝的表达框，更多的菌株的耐药性来自于其他未知因素。

在某种程度上，由于通过直接筛选获得多拷贝菌株有一定的难度，人们发展了另外一
种获得高拷贝和高重组蛋白表达水平的菌株的方法 (Sunga et al., 2008)。 简单地说, 使用更高药物浓度从在较低药物浓度水平筛选出来的只具有一个或几个表达框拷贝的毕赤酵母转化子中筛选获得具有更高拷贝表达框的菌株, 也就是在逐渐提高浓度的抗生素平板上划线来进行筛选。例如，在 100 ug/m L 的抗生素平板上筛选获得最初的转化子，接下来将这些转化子在含有 500 ug/mL 的抗生素平板上划线。收集在较高抗生素浓度下能够生长的克隆作为单个菌 株 ，然后确认这些菌株中的一个或多个具有升高的重组蛋白表达水平以及通过 P C R 确认高耐药性的获得缘于含有较多拷贝的载体。一旦某个菌株被确认为是更高表达水平/更多拷贝数的菌株，就重复之前的步骤继续用更高的抗生素浓度 (2 mg/mL) 进行筛选。再 一 次获得更高耐药性的菌株并检测重组蛋白的表达量和载体拷贝数。这 种反复筛选的过程称为转化后载体扩增法 （p 〇 sttransformationa[ vectoramplification,PTV A)。利用这个方法可以获得具有多个头尾相接载体拷贝的菌株, 这些载体通常整合进基因组的单一位点。对 P T V A 法筛选得到的克隆的分析显示，它们中有4 0 % 的载体拷贝数有 3〜5 倍的增加。被称为「头奖」(jackpot) 的那些克隆具有 10 个以上的表达载体的拷贝，它们占所筛选出的克隆的 5 % 〜6 % , 某些克隆的重组蛋白的产量具有相应比例的提高。

尽管这种载体拷贝数扩增过程的分子机制仍然不清楚, 但对该过程已经有了一些关
键发现。首先，这种扩增能够在含有任何一种载体的菌株中小比例自然地发生。其 次 ，PTVA 过程导致了整个载体的扩增，而不仅仅是扩增载体的一部分, 如耐药基因。显而易见 ，这点在需要获得均一重组蛋白产物时非常重要。再次，D N A 印迹数据表明，所有的拷贝都像原始拷贝一样，在相同的位置插入到毕赤酵母基因组中，且以首尾相连的构象存在。

最后指出的是，PTVA 法对具有其他药物抗性筛选标记的载体同样有效。并不仅限
于抗生素载体。因 此 , 这个扩增过程似乎是该种酵母菌对高药物浓度的一个通常的反应。考虑到其他品种的酵母菌也有类似的同源重组系统，这个技术也应该适用于其他种类的酵母菌。##一、培养基和微生物操作技术
在 实 验 室 水 平 培 养 毕 赤 酵 母 菌 及 其 他 大 部 分 酵 母 菌 的 技 术 与 培 养 大 肠 杆 菌 和 酿 酒 酵母 菌 类 似 。最 常 用 的 丰 富 培 养 基 是 Y P D [ 1 % 酵 母 提 取 物（yeast extrac0 、2 % 蛋 白 胨
(peptone) 、2 % 葡 萄 糖（dextrose) ] 培 养 基 ，最 常 用 的 确 定 成 分 培 养 基 是 Y N B 培 养 基0. 6 7 % 的 含 硫 酸 铵 不 含 氨 基 酸 的 酵 母 氮 源（yeast nitrogen base) 、2 % 葡 萄 糖 、50 p g / m L
的 任 何 生 长 必 需 的 氨 基 酸 和 核 苷 酸 ]。必 赤 酵 母 利 用 甲 醇 生 长 时 需 要 将 培 养 基 中 的 葡 萄 糖替 换 成 0 . 5 % 的 甲 醇 。交 配 /产 孢 (mating/spomlation) 培 养 基 由 0 . 5 % 乙 酸 钠 、1 % 氯 化 钾 、1 % 葡 萄 糖 组 成 。培 养 基 中 加 入 2 % 琼 脂 后 可 以 制 成 培 养 平 板 (Petri plate)。培 养 通 常 在30°C 进 行 。在 Y P D 液 体 培 养 基 中 ，毕 赤 酵 母 的 代 时 大 约 是 90 m i n ; 在 确 定 成 分 的 培 养 基 中代 时 大 约 是 3 h 。如 果 甲 醇 作 为 唯 一 碳 源 ，那 么 在 确 定 成 分 培 养 基 中 的 代 时 大 约 是 5 h 。

二、遗传株的构建

尽管毕 赤 酵 母 有 多 种 类 型 的 标 志 物 (marker)，但 满 足 研 究 人 员 的 目 标 标 志 物 组 合 可能 并 不 存 在 。因 此 ，构 建 一 套 具 有 最 理 想 标 志 物 的 宿 主 菌 是 很 有 必 要 的 。构 建 菌 株 的 第
— 步是 交 配 并 筛 选 二 倍 体 (diploid)(Tolstorukov and Cregg, 2008)。 因 为 毕 赤 酵 母 在 功能 上 是 同 宗 结 合 的 (homothallic), 且 同 株 的 细 胞 间 也 会 发 生 交 配 ，因 此 在 计 划 进 行 交 配 时
不 用 考 虑 菌 株 的 交 配 型 。但 是 , 毕 赤 酵 母 间 的 交 配 效 率 较 低 ，因 此 进 行 交 配 的 菌 株 具 有 互补的标记是非常必要的，这些标记能够允许杂交产生的二倍体选择性生长但抑制自身交配产生的二倍体和亲代株的生长。营养缺陷（auxotrophic) 标记在使用时最为便利。但是能够影响生长或其他表型的基因突变，如影响对甲醇或某种氮源（甲胺) 利用的基因突变也是很好的标记。下面是毕赤酵母交配的操作步骤。

1. 交 配 ，生成二倍体

(1)首先 从 Y P D 平板上挑取待交配菌株的新鲜克隆 (不要超过 1 周），然 后 在 另 外 2块 Y P D 平板上分别划出多条平行的菌线。

(2) 30°C 培养过夜，将 2 块划线平板上的酵母菌转移到 1 块无菌的丝绒布上, 此时，要 使 2 块平板上的菌线互相垂直。

(3) 将丝绒布上互相交叉的菌线转移到交配/孢子生成平板上，室 温 下 培 养 2〜3 天后开始交配。

(4) 在培养后，将交配/孢子生成平板上的酵母菌影印复制到另一个含有合适培养基
的琼脂平板上筛选互补的二倍体。二倍体克隆会在 30°C 孵 育 2〜3 天后长在划线的交叉处 。毕赤酵母二倍体的大小大约是单倍体的 2 倍 ，通过光学显微镜可以依据孢子的大小和较高的孢子生成效率来辨识。

(5) 在二倍体选择培养基上通过划菌线的方法得到二倍体的单克隆。

(6) 在缺少氮源的情况下，毕赤酵母二倍体能高效地进行减数分裂并生成孢子。为
了使二倍体进入这种生命状态，用平板影印法或用接种环直接将新鲜二倍体克隆 (生长在添加有葡萄糖的 Y P D 平板上) 转移到交配/孢子生成平板; 在室温培养 3〜4 天 。所有生成孢子的毕赤酵母在孢子囊中会聚集红色色素，因此生成孢子褐色的二倍体可以很容易地与相对白色的单倍体区别开来。还可以通过普通显微镜或相差显微镜观察培养中出现的大量子囊 (a s d) 来辨识出二倍体。

2. 随机孢子分析

毕赤酵母孢子很小且彼此黏在一起。这使得通过显微操作技术分离四分孢子（ tetrad dissection) 变得很难。因此，获得的孢子需要进行随机孢子分析 ( r a n d o m spore analysis，R S A )，过程如下所述。

( 1 ) 用接种环将毕赤酵母孢子 (来自上一过程第 6 步) 转移到装有 0. 25 m L 无菌水的I.5 m L 离心管中，涡旋振荡混匀。

(2) 在通风橱中向孢子样品中加人 0. 25 m L 二乙醚 (diethyl ether), 室温彻底祸旋振荡 大 约 5 m i n 。用乙醚处理可以选择性的杀死存留在孢子中的营养体。

(3) 仍然在通风橱中，离 心 2 m i n ，吸出上层的乙醚，用下层的水重悬孢子沉淀。取出10 uL 或 I O O uL 重悬液涂布到非选择 Y P D 平板。

(4) 30°C 培养 4〜5 天 ，挑取单克隆在新鲜 Y P D 平板上划线，作为进一步分析用的主平板（master plate)。

(5) 将主平板上的菌落影印复制到含有合适分析培养基的一系列平板上。或者, 直
接影印复制最初的平板上的 1 〇〇 〜600 个克隆。例 如 ，h 1 S4 菌 株 和 arg4 菌株交配后获得的孢子可以在添加有葡萄糖的 Y N B 培养基中进行分析。该培养基中的氨基酸添加情况如下:①不添加氨基酸;②添加精氨酸;③添加组氨酸;④添加精氨酸和组氨酸。

(6) 比较鉴定平板上各个克隆的表型以发现具有所要表型的克隆。

(7) 选择若干具有合适表型的克隆在非选择性培养 (如 Y P D ) 平板上划线, 从每个克隆划线产生的单克隆中挑取克隆，单个克隆在同一套鉴定平板上重新鉴定。该步骤非常重要，因为毕赤酵母的孢子一个挨一个非常紧密的黏附在一起, 因此其萌发产生的克隆通常包含从不止一个孢子分化出来的细胞。孢子聚集的另一个结果是标记基因并不是按照I : 1 的比例分离 (segregate), 而是倾向于显性 (dominant) 表型或野生型表型。例 如 ，上述 his4 菌 株 和 arg4 菌株交配时，His⁺A r g ⁺ 表 型 的 孢 子 所 占 比 例 超 过 预 计 的 2 5 % ，而His^- A r g ^- 表型的孢子数量则低于预期。

三、基因制备和载体选择

在选择毕赤酵母表达载体时首先要考虑的是需要分泌表达还是胞内表达。一 般的经
验做法是与该蛋白质在天然宿主中的表达途径一样: 如果天然宿主是胞内表达该蛋白质,那么就应该在酵母菌中胞内表达; 如果天然宿主是分泌表达该蛋白质, 那么就在酵母菌中分泌表达。尽管存在例外, 但是最好还是遵循这个规则，因为胞内和分泌的环境非常不同，如果在不合适的空间合成蛋白质将导致其错误折叠和失活。人们构建了一系列的载体用于毕赤酵母的表达，这些 载 体 的 名 称 和 详 细 信 息 可 以 在 Lin-C e r e g h i n o 和 Lin C e -reghino(2008) 及 littp://w w w .biogrammatics,c o m (图 13. 1) 中找到。

为了将一段基因克隆人毕赤酵母的表达载体中，可以使用合适的引物通过聚合酶链
反应对模板进行扩增。当 D N A 需要优化或基因需要改变的时候，从头合成法可以使克隆变得简单。在任何情况下，在基因末端都要加上限制性酶切位点以方便克隆。例 如 ，E c o R I 位点可以加在基因 5 ¾ (含有 A T G )，JV 〇 ( I 位点可以加在 3’端, 这样就可以很方便地克隆人 p P I C Z 系列载体(Invitrogen， Carlsbad，C A ) 中，当然，前提是所要克隆的基因序列上不存在这些酶切位点。对 来 自 Biogrammatics 公司的毕赤酵母表达载体来说，
基因两侧可以添加 11S 型限制性内切核酸酶的酶切位点和「无缝」克隆序列以构建一个理想的克隆表达载体。

克隆一个分泌蛋白的基因要更复杂一些。当使用该蛋白质的天然分泌信号时克隆过
程与胞内表达时一样; 但是, 当使用外源信号序列时就会面临一些选择，如表达载体上有酿酒酵母 a 交配因子 (aM F ) 的分泌信号，此 时 ，插入的目标基因就必须要与该信号肽的编码序列形成一个正确阅读框。《交配因子分泌信号常用于分泌表达，因为已经证明它能够很好地分泌表达多种重组蛋白。尽管用《M F 可以成功地分泌表达重组蛋白，但有时在目标蛋白质的 N 端 aM F 不能被正确地加工。此时 ，需 要 对 aM F 进行修饰或用其他的分泌信号才能获得正确加工的蛋白质。为了正确地加工蛋白质，《M F 信号肽序列和目标蛋白质 N 端之间或许需要插人两个谷氨酸-两氨酸重复序列。 Biogr a m m a t i c s 的载体 p J A Z -a M F 可以用来构建含有谷氨酸-丙氨酸重复序列的重组体。 Biogr a m m a t i c s 的其他载体,如 p J A Z -a M F -K R , 它在克隆位点上不含有谷氨酸和丙氨酸重复序列。要 想 在 p P I C Z a 载体上利用 a M F 信号，必须在基因的 5’端添加一定的序列，这样当将外源序列连接到载体上时，aM F 信号序列可以得到重建 (不管 aM F 中是否含有谷氨酸-丙氨酸重复的编码序列）。通常 ，用于切割 p F I C Z 载 体 的 X A o [位 于 a M F 信号序列中，为了重建信号序列，需要合成一段寡聚核苷酸：

「A B C D E F …」表示编码成熟重组蛋白第 1 个 和 第 2 个氨基酸残基的核苷酸序列。这个寡聚核苷酸将与成熟蛋白的基因的 5’端形成正确的连接，同时恢复了 aM F 序列缺失的部分。类似的, 用于将基因克隆到 Biogrammatics 载体中的无缝克隆技术使用 I I S 型限制性酶切位点，将 A B C D E F 与 aM F 信号肽序列的 C 端最后一个丙氨酸 (A l a) 的编码序列连接起来。该酶产生了一个 4 个碱基的黏端，这 4 个碱基包括了谷氨酸 (G l u ) 的最后一个编码核苷酸和丙氨酸 (Ala) 的编码核苷酸。

四、电穿孔转化法

目前至少有 4 种 不 同 的 方 法 可 以 将 外 源 质 粒 D N A 导 人 毕 赤 酵 母 中 ： 原生质体(spheroplast-generation) 转 化 法 、氯 化 锂（L i C l) 转 化 法 、 P E G 1000 (polyetheleneglycollOOO) 转化法和电转化法 (electroporation)。电转化法是最常用的，因此，在此详细列 出 Becker 和 Guarante 改良的电转化法的操作步骤。至于其他方法，读者可以参考分
子生物学方法毕赤酵母卷 (Cregg， 2008; HigginsandCregg, 1998)。

五、DNA 的制备

对 于 所 有 的 转 化 方 法 ，为 了 将 外 源 D N A 整 合 到 毕 赤 酵 母 基 因 组 中 ，人 们 通 常 使 用 线状 质 粒 D N A 。线 状 质 粒 D N A 末 端 的 序 列 与 宿 主 基 因 组 整 合 位 点 的 序 列 同 源 ，通 过 一 次单 交 换 完 成 外 源 序 列 的 插 入 。因 此 ，质 粒 的 线 性 化 位 点 通 常 都 位 于 质 粒 上 与 毕 赤 酵 母 基因 组 同 源 的 部 分 , 如 在 启 动 子 序 列 内 (AOXI 沿 启 动 子 的 P m e I 位 点 ）。使 用 大 肠 杆 菌 制 备质 粒 后 ，用 限 制 性 内 切 核 酸 酶 使 其 线 性 化 ，经 纯 化 和 浓 缩 后 其 终 浓 度 至 少 为 1 〇 〇 n g /uL(溶 于 水 中）。至 此 ，转 化 毕 赤 酵 母 用 的 载 体 就 准 备 好 了 。

电 转 感 受 态 细 胞 的 制 备 步 骤 (Lin-Cereghino et a L ，2005)。

1. 实 验材料 (除了 D T T 和 H E P E S 过滤除菌外，所有的溶液都要高压灭菌）

( 1 ) 在 2. 8 L 的 冯 巴 赫 (Fernbach) 摇 瓶 中 配 制 500 m L 的 液 体 Y P D 培 养 基 。

( 2 ) 水 (1 L ) 。

(3) I m o l / L 山 梨 醇 (sorbitol) (100 m L ) 。

(4) 适 量 的 筛 选 用 琼 脂 平 板 。

(5) I m o l / L 二 硫 苏 糖 醇 (D T T ) (2.5 m L ) 。

(6) B E D S 溶 液 (9 m L ):10 m m o l /L i V -二 羟 乙 基 甘 氨 酸 -氢 氧 化 钠（bicine^N a O H ),p H 8. 3 , 3 % 乙 二 醇（ethylene glycol) ， 5 % 二 甲 基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，D M S O ) ，
I m o F L 山 梨 醇 ，0•I m o l / L D T T 。

(7) I m o l /L 羟 乙 基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 (H E P E S ) 缓 冲 液 ，P H 8. 0(50 m L ) 。

(8) 无 菌 的 250 m L 离 心 管 。

(9) 无 菌 的 电 转 杯（electroporation cuvette) 。

( 1 0 ) 电 转 仪 ：B T X Electro Cell Manipulator 600 (B T X ， San D i e g o , C A );Bio-RadG e n e PulserCBio-R a d , Hercules, C A ) ；Electroporator II (Invitrogen， S a n D i e g o , C A ) 。
电 转 参 数 因 仪 器 型 号 不 同 而 有 所 不 同 。使 用 前 请 阅 读 对 应 型 号 的 说 明 书（Becker andG u arante, 1991； G r e y and Brendel, 1995； Pichia Expression KitInstruction M a n u a l ；
Stowers et al. , 1995)。

2. 操作方法

(1) 挑 取 在 琼 脂 平 板 上 的 新 鲜 毕 赤 酵 母 单 克 隆 接 种 在 10 m L Y P D 培 养 基 中 ，30°C 振荡 培 养 过 夜 。

(2) 将 过 夜 培 养 的 酵 母 菌 接 种 到 装 有 500 m L Y P D 的 2. 8 L F e r a b a c h 培 养 瓶 中 ，此时 〇D _600nm, 大 约 为 0•0 1 ，培 养 至 O D _600nm为 I.0 左 右 (大 约 12 h ) 。

(3) 4°C 2000 g 离 心 收 集 细 胞 ，弃 上 清 液 ，用 1 〇〇 m L 含 有 H E P E S ( p H 8.0,200 m m o l /L ) 的 Y P D 培养基重悬沉淀，转 移 到 250 m L 离心管中。

(4) 加 入 2. 5 mL 的 I mol/L DTT，轻柔混匀。

(5) 30°C 缓慢旋转孵育 15 m i n 。

(6) 向培养物中加入 150 mL 冷水，4°C 离心; 再用 250 mL 冷水离心清洗。从这步开始 ，保持细胞在冰冷环境中并且不要振荡重悬细胞 (最好用吸管缓慢吹打)。

(7) 用 20 mL 冷 的 I m 〇 l/L 山梨醇洗细胞，然 后 用 0.5 mL冷的Im ol/L 山梨醇重悬 (细胞悬液的终体积为 I.0〜I.5 mL)。

(8) 直接使用这些未经冷冻的感受态细胞能获得最多的转化子。

(9) 每 个 I.5 mL 离心管分装 40 pL 感受态细胞, 置于一 70°C 冻存。

3. 电 转 步 骤

(1) 将 I ug 溶于水的线状质粒 DNA(体积不要超过 5 ML) 加人装有 40 uL 冻存的或新鲜的感受态细胞的离心管中，将混合物转移到在冰上预冷的 2 mm 内径的电转杯中。

(2) 用电转仪制造商建议的针对酵母的参数进行电转 (表 13. 1)。

(3) 电击后立即加人 0. 5 mL 预 冷 的 I mol/L 山梨醇和 0. 5 mL 预冷的 YPD，然后将电转杯中所有的菌液转移到一个 1. 5〜2. 0 mL 的离心管中。

(4) 将离心管置于 30°C 缓慢摇动 (100 r/min)，培 养 3. 5〜4 h。

(5) 取 1 份电转产物涂布在选择性琼脂平板上，培 养 2〜4 天。

(6) 为了避免混合克隆, 在进行下一步分析之前，至少需要再一次挑单克隆在选择培养基上划线培养以获得单克隆。

4. 电 转 感 受 态 毕 赤 酵 母 的 快 速 制 备

(1) 在 5 mL YPD 培养基中接种毕赤酵母，30°C 摇动培养过夜。

(2) 在 装 有 50 mL YPD 培养基，能良好通气的大培养瓶中，稀释过夜培养的毕赤酵母菌液至 OD_600nm 0. 15〜0. 20。

(3) 30°C 摇动培养至 OD_600nm〇.8〜1. 0(4〜5 h)。

(4) 室 温 5OOg 离 心 5 min 收集菌体，弃掉上清液。

(5) 在加 有 DTT 的 9 mL 预冷 的 BEDS 溶液中重悬沉淀。

(6) 30°C 摇 动 孵 育 重 悬 液 5 m i n 。

(7) 室 温 500 g离心 5 m i n 收 集 菌 体 ，用 I m L B E D S 重 悬 (不 含 有 D T T ) 。

(8) 按 照 上 述 电 转 化 步 骤 进 行 电 转 , 或 者 立 即 分 装 细 胞 并 将 其 冻 存 在 一 80°C 。

六、重组蛋白表达菌株的鉴定

酵 母 表 达 系 统 已 经 成 功 地 用 于 重 组 蛋 白 的 大 量 制 备 ，如 I L 酵 母 培 养 液 上 清 液 中 能够 获 得 1〜 10 g 分 泌 表 达 的 重 组 蛋 白 。但 是 ，可 能 在 初 次 尝 试 表 达 时 不 能 够 在 考 马 斯 亮蓝 染 色 的 凝 胶 中 看 到 目 标 蛋 白 质 的 条 带 。因 此 ，非 常 有 必 要 在 使 用 构 建 好 的 重 组 菌 株 进行 蛋 白 质 表 达 前 ，准 备 好 一 种 或 多 种 更 为 灵 敏 的 检 测 方 法 。可 以 利 用 目 标 产 物 的 酶 活 性 、目 标 产 物 上 融 合 的 表 位 标 签 或 目 标 产 物 的 特 异 性 抗 体 来 进 行 检 测 。但 关 键 在 于 : 建 立 灵敏 检 测 方 法 的 工 作 应 该 与 表 达 同 时 进 行 或 先 于 表 达 进 行 。如 下 例 所 示 ，好 的 检 测 方 法 能够 大 大 方 便 菌 株 的 构 建 。

检 测 酵 母 表 达 的 外 源 蛋 白 最 便 捷 的 方 法 是 平 板 活 性 实 验 。该 实 验 可 以 进 行 粗 略 的 定量 。通 过 平 板 影 印 或 别 的 技 术 将 菌 落 影 印 到 另 一 个 平 板 上 ，能 够 对 100〜 1 0 0 0 个 转 化 子的 表 达 水 平 进 行 直 接 比 较 。

图 I3. 2 显示了 使 用 平 板 活 性 实 验 检 测 分 泌 表 达 的 肌 醇 六 憐 酸 酶（phytase) 的 例 子 。这 种 酶 可 降 解 肌 醇 六 磷 酸 (phytate)，它 能 使 琼 脂 平 板 上 表 达 该 酶 的 酵 母 克 隆 的 周 围区域变 得 澄 清 。澄 清 区 域 的 大 小 与 肌 醇 六 磷 酸 酶 的 分 泌 量 相 关 。第 二 个 例 子 ，毕 赤 酵 母 胞 内表 达 细 菌 β-内酰胺酶 (β-lactamase)( 图 13.3)。 通 常 毕 赤 酵 母 的 克 隆 呈 黄 色 ，表 达 斤 内 酰胺 酶 时 会 由 粉 色 转 为 紫 色 。紫 色 的 深 度 与 酶 的 表 达 量 有 关 ，在 这 里 ，也 就 是 与 菌 株 的 表 达框 的 拷 贝 数 有 关 。最 后 指 出 ： 如 下 所 述 ，可 以 用 高 质 量 的 针 对 标 签 区 域 或 重 组 蛋 白 自 身 的多 克 隆 抗 体 或 单 克 隆 抗 体 进 行 平 板 抗 体 实 验 或 酵 母 印 迹 实 验 。

转 化 子 被 筛 选 出 来 后 ，分 离 出 单 细 胞 并 收 集 在 作 为 主 平 板 的 平 板 上 ，来 源 于 多 个 转 化子 的 样 品 将 被 用 于 检 测 外 源 蛋 白 的 表 达 情 况 。在 这 之 前 ，可 以 通 过 PCR 筛 选 含 有 重 组 基因 的 转 化 子 。如 下 所 述 ，用 玻 璃 珠 破 碎 法 在 无 细 胞 抽 提 系 统 中 提 取 出 基 因 组 D N A ，用 其作 为 模 板 ，使 用 与 重 组 基 因 两 侧 互 补 的 引 物 进 行 PC R 反 应 。根 据 使 用 何 种 启 动 子 表 达 蛋白 (诱 导 型 的 和 组 成 型 的 ) 和 使 用 哪 种 表 达 载 体 (胞 内 的 或 分 泌 的），有 不 同 的 检 测 方 法 用于 表 达 蛋 白 的 检 测 。

( 1 ) 如 果 目 的 基 因 的 表 达 是 组 成 型 的 ，接 种 单 克 隆 在 YPD 培 养 基 中 ，良 好 通 气 的 情况 下 培 养 2 〜3 天 ，在 这 段 时 间 里 可 以 用 各 种 可 行 的 检 测 方 法 在 不 同 的 时 间 点 分 析 蛋 白 质的 表 达 。

( 2 ) 对 于 甲 醇 诱 导 型 表 达 ，首 先 在 Y PD 培 养 基 中 接 种 单 克 隆 并 培 养 17〜 24 h ，然 后转 移 到 添 加 有 甲 醇 的 新 鲜 培 养 基 中 诱 导 。诱 导 时 通 气 要 好 , 菌 的OD_600nm在 1 0 左 右 ，在装有 2 n iL 培 养 基 (含 有 0 . 5 % 甲 醇 ) 的 15 m L 试 管 中 进 行 。对 于 胞 内 表 达 的 蛋 白 质 ，甲醇诱 导 6〜 12 h 就 足 够 了 。

胞内表达的样品需要制备细胞提取物后进行分析。收集培养 10〜12 h 的酵母菌，使用玻璃球破碎法裂解细胞。准 备 10〜50 个 OD_600nm单位的细胞, 用 150 uL 裂解缓冲液重悬 。加人等体积用无菌的酸洗过的直径 0.45 m m 的玻璃球。最大转速涡旋振荡混合I m in, 然后将混合物放置冰上 I m in; 重复上述操作至少 5 次。或者将装有样品的离心管放置在可以容纳多个离心管的涡旋振荡器中。将振荡器置于 4℃；冰盒中或冷室中，以最高速振荡大约 10 m in。在显微镜下检查细胞的破碎情况，此时, 应该可以观察到 8 〇%〜9 0 % 的细胞已经破碎。细胞破碎后，将细胞碎片和缓冲液一起转移到一个新的离心管中，另 用 100 uL 裂解缓冲液振荡清洗玻璃球然后将洗液转移至上述同一离心管中。 4℃高速离 心 5 m i n ，将包含目标蛋白质的上层水相转移到新离心管中。 这 就 是 用 于 S D S -p A G E 、蛋白质印迹或酶学分析的粗提蛋白质样品。

分 泌 蛋 白 在 培 养 基 中 积 累 很 缓 慢 ，至 少 要 培 养 2 天 才 能 达 到 高 峰 。可 以 振 摇 诱 导 2〜5 天 ，期 间 每 12 h 加 入 新 鲜 甲 醇 至 终 浓 度 为 〇 •5 % 并 收 集 50〜 100 上 清 样 品 。上 清 样
品 可 以 进 行 SDS-PAGE、蛋 白 质 印 迹 或 酶 学 反 应 分 析 ，也 可 以 一 20°C 冻 存 。

七、分 析 方 法 的 建 立 —酵母印 迹 法

使用抗体的各种不同分析方法有许多相似之处。酵母克隆蛋白质印迹法是一种很有
用的、酵母特异性的抗体分析方法。它有时候被称为分泌蛋白的酵母印迹法 (「Yeastem」Blot)(图 13. 4)。对于标准的蛋白质印迹法操作步骤，请 参 考 Sam brook 等 (1989)。

酵 母 印 迹 是 一 种 很 便 捷 的 直 接 在 平 板 上 大 量 筛 选 重 组 蛋 白 表 达 菌 株 的 方 法 。但 是 ，读 者 应 该 明 白 ，克 隆 周 围 光 晕 的 大 小 和 重 组 蛋 白 的 量 并 不 总 是 线 性 相 关 ，这 种 方 法 得 出 的所 有 结 果 都 应 该 用 标 准 的 蛋 白 质 印 迹 法 或 其 他 的 检 测 方 法 加 以 验 证 。酵 母 印 迹 法 的 操 作步 骤 如 下 所 述 。

( 1 ) 将 琼 脂 平 板 表 面 的 新 鲜 酵 母 克 隆 用 标 准 的 平 板 影 印 法 转 移 到 一 张 无 菌 的 Whatman No. 1 滤 纸 上 。滤 纸 应 剪 成 大 小 能 刚 好 放 进 平 板 中 。

( 2 ) 将 粘 有 酵 母 细 胞 的 滤 纸 放 在 含 有 适 量 诱 导 培 养 基 的 新 鲜 平 板 表 面 ，然 后 培 养 1〜2 天 。

( 3 ) 准 备 一 张 大 小 和 上 述 滤 纸 一 样 的 硝 酸 纤 维 素 膜 ，用 至 少 15 m L 电 转 缓 冲 液[25mmol/L Tris(pH8.5),0.2 111 〇 1/乙甘氨酸，20% 甲 醇 将 该 膜 浸 泡 5min或更长时间。在 电 转 缓 冲 液 中 再 浸 湿 两 张 剪 好 的 滤 纸 。

( 4 ) 按 照 下 述 方 法 准 备 滤 纸 和 硝 酸 纤 维 素 膜 的 三 明 治 。

① 将 一 张 滤 纸 放 置 在 印 迹 装 置 的 阳 极 (移 除 膜 之 间 的 所 有 气 泡 是 很 有 必 要 的 ，可以用 移 液 管 在 滤 纸 表 面 滚 动 去 除 气 泡）。

② 将 浸 湿 的 硝 酸 纤 维 素 膜 放 在 滤 纸 上 。

③ 将 影 印 有 平 板 上 酵 母 细 胞 的 滤 纸 放 在 硝 酸 纤 维 素 膜 的 上 面 。

④ 放 置 第 二 层 浸 湿 的 滤 纸 在 有 酵 母 细 胞 的 滤 纸 上 层 。

⑤ 最 后 ，将 阴 极 板 放 在 三 明 治 的 最 上 层

(5) 用恒定的电流 (1〜4 mA/cm2) 作 用 I h 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。

(6) 移走硝酸纤维素膜，将 其 在 15 m L 的 T B S 缓 冲 液 [50 m m d/L Tris-HCKpH7.6), 150m m ol/L 氯化钠] 中洗 5 m in。之后, 将 T B S 缓冲液换成含有 1% 〜5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 TBST(加 Tween-20 在 T B S 至终浓度为 0. 0 5 % ) 。置硝酸纤维素膜于封闭缓冲液中, 室温缓慢摇动 I h 。

(7) 将滤膜转移到 15 HiL T B S T 中室温摇动 5 m in。

(8) 准 备 好 15 mL 封 闭 缓 冲 液 稀 释 的 一 抗（按 照 供 货 商 推 荐 用 量 稀 释 ，一般为0.5 ug/mL)。

(9) 将膜和一抗在 2〜8°C 缓慢摇动孵育过夜 (也可以根据所用抗体，缩短至在室温下孵 育 1〜3 h)。

(10) 用 15 mL T B S T 缓冲液至少洗膜 4 次 (每 次 5 min)，最后用新鲜 T B S T 快速冲洗 膜 。

(11) 根据供货商推荐的用量在封闭缓冲液中稀释酶标二抗 (一 般 在 15 m L 封闭缓冲液 中 加 3 ， 抗体)。

(12) 将稀释的二抗和膜于室温摇动孵育 I h 。

(13) 重复步骤 (10)。

(14) 在暗室中，根据供货商的建议，使 用 显 色 剂（visualization reagent) 处 理 膜（如Pierce E C L 蛋白质印迹底物），然后用滤纸移除膜上多余的液体，将膜放置在塑料的保护盒 中 ，使 用 X 射线感光胶片对整张膜曝光 30 s 至数分钟。每个克隆周围的信号强度和大小大致可以反映出该克隆/菌株表达分泌重组蛋白的水平。

八、重组蛋白的翻译后修饰 (蛋白酶和糖基化）

在毕赤酵母中包括蛋白酶解和糖基化在内的翻译后修饰会影响重组蛋白的质量。

如果最初的 SDS-P A G E 分析显示目标蛋白质发生了降解, 那么可以尝试毕赤酵母的蛋白酶缺陷株。较低的重组蛋白表达水平和有活性的或有免疫活性的产物小于全长产物显示蛋白酶发生了降解。降解的蛋白质也可能在 P A G E 电泳上显示为弥散的条带，条带分布在从分子质量的正常大小到较小的位置。毕赤酵母菌株 SMD1168(pep4 his4) 的大部 分 P E R 基因被删除 (Gleeson et al.， IM S)。该基因负责活化毕赤酵母液泡中的许多蛋白酶。这些蛋白酶最初以非活性的酶原形式进入液泡，在 液 泡 中 被 P £T 4 产物激活。尽管分泌型的重组蛋白不会进人液泡，但是它们在培养基中会接触到小量细胞裂解后释放的此类蛋白酶毕赤酵母在培养时的密度非常高, 这会导致在培养基中的液泡蛋白酶浓度达到不能忽视的水平。为 了 利 用 PEP4 菌株进行表达，你要么使用你的质粒转化SMD1168(p 印 4 his4) 或 SMD1168 H (pep4) 等菌株，要么在已经表达目标蛋白质的菌株上删 除 基因。 为了确定缺失PEP4 对蛋白质表达是否有利，需要在平行诱导完成后对 野 生 型 和 缺 失 株 表 达 的 重 组 蛋 白 进 行 检 测 。注意:平板上保存的 P E P 4 缺失株会更快死亡，而且不如野生型菌株容易转化，生长得更慢，在甲醇培养基中更难诱导，尤其是 P f P4 缺失菌株很难与其他非 P E P 4 毕赤酵母菌株交配。

如 果 S DS- P A G E 显 示 毕 赤 酵 母 中 表 达 的 重 组 蛋 白 较 预 期 的 大 ，或 者 大 小 不 一 ，那么该 蛋 白 质 可 能 被 糖 基 化 了 。你 应 该 首 先 检 査 氨 基 酸 序 列 以 寻 找 潜 在 的 糖 基 化 位 点 :A S N -X -S e r / T h r 序 列 是 存 在 JV-糖 基 化 的 信 号 ; 任 何 S e r 或 T h r 位 点 的 一 O H 基 团 都 可 能 出 现O 糖 基 化 。可 以 用 肽 N-糖 苷 酶 F (FPNGaSe F ，peptideN -glyc 〇 sidase F ) 处 理 可 疑 的 糖基 化 蛋 白 以 去 糖 基 化 ，然 后 通 过 S D S ^ P A G E 对 产 物 大 小 进 行 检 测 。 从 http://www.neb.com/nebecomm/piroducts/productP0704. asp 可 以 找 到 一 个 很 好 的 蛋 白 质 去糖 基 化 的 方 法 。如 果 经 过 糖 苷 酶 处 理 后 蛋 白 质 的 分 子 质 量 变 小 ，而 且 更 为 均 一 ，那 么 几 乎可 以 确 定 这 个 蛋 白 质 是 被 糖 基 化 了 。

九、挑 选 具 有 多 拷 贝 表 达 框 的 克 隆

在毕赤酵母表达系统中，最常用的增加重组蛋白表达量的方法或许就是增加菌株中表达框（expression cassette) 的拷贝数（Brierley，1998; Thill et al.，1990)。有两种方法可以用来构建具有多拷贝表达框的菌株。第一种方法是构建一个拥有多个头尾相接的表达框 (Brierley，1998) 的载体。构建这个载体的关键是载体的表达框的两侧有限制性内切核酸酶的酶切位点, 而且必须能够切出互补的末端（如 Baw HI-B g m 、SaZI-X/io I 这样的组合）。重复进行切开和插人的操作会产生一系列表达框拷贝数逐渐增多的载体。这种方案有一个独有的优势 (尤其在人用药物制品方面） ，即表达框的确切数量非常清楚，而且可以通过 D N A 测序进行直接确认。

这种筛选方法的一个缺点是很难获得足够多的克隆用于筛选含有高拷贝表达框的菌株 。首先 ，耐高浓度药物的转化子数量很低，通常只占低耐药性 (1 〇〇 ug/m L 的抗生素)转化子数量的〇.1 % 〜1. 0 % 。因此，只有在最高转化效率的情况下，才可能会有耐高浓度药物的转化子出现。其 次 ，需 要 50〜100 个转化子来筛选高拷贝菌株，这是因为在显示高耐药性的转化子中，只 有 1 % 〜5 % 是由于细胞内具有多拷贝的表达框，更多的菌株的耐药性来自于其他未知因素。

在某种程度上，由于通过直接筛选获得多拷贝菌株有一定的难度，人们发展了另外一
种获得高拷贝和高重组蛋白表达水平的菌株的方法 (Sunga et al., 2008)。 简单地说, 使用更高药物浓度从在较低药物浓度水平筛选出来的只具有一个或几个表达框拷贝的毕赤酵母转化子中筛选获得具有更高拷贝表达框的菌株, 也就是在逐渐提高浓度的抗生素平板上划线来进行筛选。例如，在 100 ug/m L 的抗生素平板上筛选获得最初的转化子，接下来将这些转化子在含有 500 ug/mL 的抗生素平板上划线。收集在较高抗生素浓度下能够生长的克隆作为单个菌 株 ，然后确认这些菌株中的一个或多个具有升高的重组蛋白表达水平以及通过 P C R 确认高耐药性的获得缘于含有较多拷贝的载体。一旦某个菌株被确认为是更高表达水平/更多拷贝数的菌株，就重复之前的步骤继续用更高的抗生素浓度 (2 mg/mL) 进行筛选。再 一 次获得更高耐药性的菌株并检测重组蛋白的表达量和载体拷贝数。这 种反复筛选的过程称为转化后载体扩增法 （p 〇 sttransformationa[ vectoramplification,PTV A)。利用这个方法可以获得具有多个头尾相接载体拷贝的菌株, 这些载体通常整合进基因组的单一位点。对 P T V A 法筛选得到的克隆的分析显示，它们中有4 0 % 的载体拷贝数有 3〜5 倍的增加。被称为「头奖」(jackpot) 的那些克隆具有 10 个以上的表达载体的拷贝，它们占所筛选出的克隆的 5 % 〜6 % , 某些克隆的重组蛋白的产量具有相应比例的提高。

尽管这种载体拷贝数扩增过程的分子机制仍然不清楚, 但对该过程已经有了一些关
键发现。首先，这种扩增能够在含有任何一种载体的菌株中小比例自然地发生。其 次 ，PTVA 过程导致了整个载体的扩增，而不仅仅是扩增载体的一部分, 如耐药基因。显而易见 ，这点在需要获得均一重组蛋白产物时非常重要。再次，D N A 印迹数据表明，所有的拷贝都像原始拷贝一样，在相同的位置插入到毕赤酵母基因组中，且以首尾相连的构象存在。

最后指出的是，PTVA 法对具有其他药物抗性筛选标记的载体同样有效。并不仅限
于抗生素载体。因 此 , 这个扩增过程似乎是该种酵母菌对高药物浓度的一个通常的反应。考虑到其他品种的酵母菌也有类似的同源重组系统，这个技术也应该适用于其他种类的酵母菌。