🔥 毕赤酵母表达系统的构建

毕赤酵母表达系统是一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（a lcoholoxida se, Aox) 码基因 AOXI 和 AOX2，两者序列相似，AOX1 基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1 启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢。含 AOXI 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵，是较理想的重组真核蛋白质生产制备工具。

试剂耗材：P. pastoris GS115 菌株、限制性内切酶 Sac I、DNA Marker、琼脂糖、核酸染色剂溴化乙锭、无水乙醇、高纯质粒小量提取试剂盒、YNB（含硫酸铵、不含氨基酸）、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖、生物素、甘油、甲醇（色谱级）、 SDS-PAGE 凝胶试剂盒、2 × 蛋白上样缓冲液、BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白分子量 Marker、PVDF 膜 PCR 仪、可调式微量移液器、超净工作台、恒温磁力搅拌器、小型台式高速离心机、凝胶成像系统、电泳仪、显影系统等等。

（一）毕赤酵母重组表达载体的构建

1、基因优化设计并合成至 pPIC9K 载体

参照 Gen Bank 中目的基因序列，依照毕赤酵母密码子的偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，利用密码子优化软件对目的基因进行密码子优化，并在序列的 5'端引入了 Eco R I 酶切位点和 6 × His 的标签，在 3'端设计了 Not I 酶切位点。将优化构建好的基因序列送至生物公司合成并连接到毕赤酵母表达载体 pPIC9K 中，转化到宿主菌中获 DH5α-pPIC9K－目的基因重组菌株。

2、重组质粒的提取及测序

1）将 DH5α-p PIC9K－目的基因菌株接入 LB 液体培养基，220 rpm，37 ℃ 培养过夜，将菌液倒入 1.5 mL 离心管，12000 rpm，离心 1 min，去掉上清培养基，重复上述步骤 3~4 次，将菌体全部富集到离心管中。

2）按照高纯质粒小量提取试剂盒说明书进行 pPIC9K－目的基因质粒回收。

3）取 60 μL 准备好的 60 ℃，ddH₂O 12 000 rpm，离心 2.5 min，收集 pPIC9K-目的基因质粒产物于 1.5 mL 离心管中，并对重组质粒进行 DNA 测序。

3、质粒线性化

1）线性化 pPIC9K－目的基因质粒

酶切体系                  50 μL

pPIC9K 目的基因    34 μL

10 × L buffer           5 μL

Sac I                        2.5 μL

ddH₂O                   8.5 μL

将酶切体系混匀，37 ℃ 酶切 3 h。

2）琼脂糖电泳鉴定

称取琼脂糖粉末 0.3 g 于三角烧瓶内，加电泳缓冲液 30 mL 混匀。微波炉多次加热熔化琼脂糖。冷却至 60~70 ℃，1:5 000 混入溴化乙锭，室温凝固。将配好的琼脂糖凝胶置于电泳槽中，加入 TAE 缓冲液，没过凝胶，10×Loading buffer

与质粒混匀，上样，电泳 140 V，电泳时间 20 min。

3）乙醇沉淀法回收线性化质粒

向鉴定正确的线性化质粒加入 3 M 的醋酸钠 5 μL，混匀。加入二倍体积的预冷无水乙醇，混匀后置于 -20 ℃ 30 min，12 000 rpm 离心 20 min，去上清。加入 1/2 体积的预冷无水乙醇，12 000 rpm 离心 20 min，去上清，室温自然风干，加 20 μL ddH₂O 水溶解 DNA。

4、毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备

1）取 GS115 冻存菌，YPD 平板划线，倒置于 28 ℃ 培养箱中培养 2~3 天。挑取单菌落接种于 5 mL YPD 培养基中，28 ℃，220 rpm 振荡过夜培养。

2）将培养 GS115 菌液按 1:100 转接到 50 mL 培养瓶中，220 rpm，30 ℃ 恒温，220 rpm 振荡培养过夜，生长至菌液 OD600=1.3-1.5。

3）4 ℃，4 000 rpm 离心 5 min，弃上清，收集沉淀菌体，冰浴 10 min 后，用 50 mL 预冷的灭菌重悬浮细胞；4 ℃，4000 rpm 离心 5 min，去上清。用 25 mL 预冷灭菌水重悬酵母菌，4 ℃，4000 rpm 离心 5 min，去上清。

4）用 20 mL 1M 山梨醇重悬酵母菌，4 ℃，4 000 rpm 离心 5 min，去上清。按照 100 μL 等量分装，-80 ℃ 冻存。

5、电转

1）处理电转杯：ddH₂O 清洗两次，注入 75% 乙醇浸泡片刻后冲洗两次。将电转杯电极狭缝对准超净台紫外灯，杯盖朝上，紫外照射消毒 30 min，ddH₂O 冲洗 3 次，冰上预冷，超净台吹风干燥。

2）电转：MD 板 28 ℃ 预热，将线性化质粒和 GS115 感受态混合均匀，轻轻注入电极狭缝中，2 000 V 5.1 ms 电转。

3）加入 1 mL，1 M 山梨醇，将菌液涂于 MD 板倒置于 28 ℃ 培养 3~6 天，观察转化子生长情况。

4）处理电转杯：用大量 ddH₂O 冲洗，并 75% 乙醇浸泡 5 min，无水乙醇冲洗，超净台吹风干燥，置于灭菌的离心筒中 -20 ℃ 保存。

6、阳性平板高拷贝克隆筛选

1）将 MD 平板上长出的 His＋克隆，用细胞刮刀将轻轻刮下，与 1 mL YPD 培养基混匀。

2）取 20 μL 涂于不同浓度梯度的 YPD+G418 平板上（浓度依次为 0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）。28 ℃ 培养 2~3 天直至有高拷贝转化子长出。

（二）重组 E－目的基因的诱导表达及表达条件优化

1、高表达 E－目的基因菌株筛选

1）YPD+G418 板上生长出 5 个菌落编号 1-5，接种于 25 mL BMGY 培养基中，220 rpm，30 ℃ 培养过夜。

2）将 1 mL 种子液转接到 50 mL BMGY 培养基中，30 ℃ 摇床，220 rpm 培养 24 h，4 ℃，4 000 rpm 离心 5 min。加 50 mL BMMY 重悬菌体，诱导表达，温度为 28 ℃，初始 pH 值为 6.0，甲醇浓度 2% 诱导 96 h。

3）取 1-5 号诱导后菌液，4 ℃，4 000 rpm 离心 5 min，取上清，40% 的硫酸铵沉淀过夜。

4）4 ℃，12 000 rpm，离心 30 min，用 100 μL ddH₂O 溶解沉淀，加入 100 μL SDS 蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃ 加热 10 min。

5）进行 SDS-PAGE 凝胶电泳实验，进行判断 E-目的基因是否成功表达。

2、重组 E-目的基因诱导条件的优化

优化诱导重组 E-目的基因的时间、甲醇剂量、温度、发酵液 pH。都可以通过 SDS-PAGE 凝胶电泳比较蛋白表达量。

3、重组 E-目的基因的鉴定及纯化

通过 Western blot 鉴定目的蛋白重组 E-目的基因、PAS 染色鉴定重组 E-目的基因糖基化、重组 E-目的基因的纯化、纯化后重组 E-目的基因除盐及非糖基化条带去除、BCA 法测定蛋白浓度。

1、注意引物的设计，可以多设计几对进行对比试验；

2、质粒提取过程中注意 RNA 的去除，可以加 RNase 消化；

3、做质粒回收过程中，要选择合适的胶浓度，避免损失过大；

4、做 SDS-PAGE 凝胶电泳时，要根据目的基因选择浓度合适的胶；

5、质粒一定要做线性化处理，环状质粒的同源重组概率低。