重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

一、重组蛋白质的诱导表达

1. 挑取转化有质粒的单菌落， 接种于3ml 选择性 LB 液体培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养过夜。

2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml（1: 20）选择性LB 液体培养基中，37 ℃，250 rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取 1 ml 样本作 为诱导前标本，10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀，－20 ℃ 冻存备用。

3. 加入 1 mol/L IPTG于菌液中，使 IPTG 终浓度为 1 mM，37℃ ，250 rpm/min振摇培养 4～5 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀， －20 ℃ 冻存备用。

4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0） 重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离， 考马斯亮蓝染色 3 小时后，脱色观察结果。

5. 选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 ℃ 保存， 准备做下一步分析及纯化。

二、重组蛋白质的分离纯化 重组蛋白质的可溶性鉴定

1. 将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysisbuffer under native conditions) 中，然后在－80℃低温冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解冻。

3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次，每次10 sec，间歇10 sec，电压200-300 V 。

4. 10000g，4℃ ，离心20 min，取上清（为溶液A ） ，－20 ℃ 保存；另将沉淀用同样裂解液 1 溶解（为溶液 B ） ，同样－20℃ 保存，供后继分析使用。

5. 将上述 A 、B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE电泳， 考马斯亮蓝染色， 比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A 溶液中，则为 可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化

1. 将菌体沉淀溶于适量裂解液 2 （Lysisbuffer under denaturing conditions）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 10000g，4℃，离心 30 min，收集上清液。

3. 将 Ni-NTAAgarose充填柱子，并连接于 Pharmarcia低压液相层析系统，用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTAAgarose，调节 A 280 值至零线。

4. 将适量上清液上样到 Ni-NTAAgarose 柱子中，并用 lysisbuffer 冲洗至 A 280值低于 0.01。

5. 分别用 5～10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2（Washbuffer 1 and2）清洗柱子，直至 A 280 值低于 0.01。

6. 用洗脱液（Elutionbuffer）洗脱重组蛋白质，在 A 280 值监测下，收集出现峰 线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS 透析，透 析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白 (BSA)为标准，采用 BIO-RAD 公司蛋白质定量试剂(proteinassay)比色测定蛋白质的含量。